ACF可溶解微针贴片缓解特应性皮炎经皮给药的研究
2026-01-29 来源:本站 点击次数:83
2025年2月由中国南方医科大学南方医院整形美容外科的Jingyan Gua研究团队在《Journal of Tissue Engineering》期刊（IF: 6.8）发表了一篇“Dissolving microneedle patch loaded with adipokines-erriched adipose extract relieves atopic dermatitis in mouse via modulating immune disorderss, microbiota imbalance, and skin barrier defects”研究论文。研究针对特应性皮炎（AD）这一慢性复发性皮肤病，此前团队已研发出一种物理提取的脂肪来源细胞外基质——脂肪胶原片段（ACF），其含大量基质结合脂肪因子，经皮内注射对AD有治疗作用，但存在药物释放控制不佳和注射疼痛等问题。鉴于微针（MN）技术在精准无痛经皮给药领域的快速发展，本研究开发了负载ACF的甲基丙烯酰化明胶/透明质酸可溶解微针贴片（ACF-MN），评估了其形态特征、机械性能、渗透能力、生物相容性和降解效率，并探究了其在卵清蛋白（OVA）诱导的AD小鼠模型中的疗效及作用机制。
摘要
特应性皮炎（AD）是一种慢性复发性皮肤病，亟需新的治疗方法。该研究团队此前研发了一种物理提取的脂肪来源细胞外基质，命名为脂肪胶原片段（ACF），经证实其含有大量与脂肪基质结合的脂肪因子，通过皮内注射对AD具有治疗效果。然而，药物释放控制难题及注射带来的不可避免的疼痛，阻碍了ACF的应用。微针（MN）是一种快速发展的无痛经皮给药技术。因此，本研究开发了一种负载ACF的甲基丙烯酰化明胶/透明质酸可溶解微针贴片。研究评估了ACF-MN的形态特征、机械性能、渗透能力、生物相容性和降解效率，并探究了其对卵清蛋白诱导的AD小鼠的疗效。结果表明，ACF-MN具有优异的渗透能力、生物相容性和降解效率，对小鼠AD的效果与新鲜制备的ACF相当。此外，通过RNA测序结合生物信息学技术探究其作用机制发现，ACF治疗可通过恢复炎症失调、微生物群失衡和皮肤屏障缺陷，对AD发挥综合治疗效果。本研究提供了一种新型的基于微针的ACF结合脂肪因子经皮给药系统，有望成为缓解AD的有效策略。
实验材料与仪器
实验材料
1.实验动物：6周龄雌性BALB/c小鼠。
2.生物材料：脂肪组织、甲基丙烯酰化明胶、透明质酸、光引发剂、聚乙烯醇、明胶、卵清蛋白、脂多糖、 Nile红染料、磷酸盐缓冲液、DISPASE®、各种神经酰胺标准品。
3.试剂盒与试剂：ELISA试剂盒、TRIzol Reagent®、逆转录试剂盒、DNA提取试剂盒、PicoGreen dsDNA检测试剂盒。
4.抗体：抗丝聚蛋白兔多克隆抗体、抗兜甲蛋白兔多克隆抗体 、二抗。
5.染色剂：4%台盼蓝溶液、10%福尔马林、苏木精-伊红（H&E）染色剂、甲苯胺蓝（TB）染色剂。
实验仪器
1.样品制备仪器：高速均质机、聚二甲基硅氧烷模具、真空设备、紫外照射设备、干燥剂、位移力测试站。
2.表征与检测仪器：光学显微镜、扫描电子显微镜、ImageJ软件（NIH）、体内成像系统、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、Illumina Hiseq 3000测序平台、Illumina NovaSeq6000测序平台、超高效液相色谱-质谱联用仪、PCR仪、石蜡包埋机、切片机。
实验过程
ACF制备
从6周龄雌性BALB/c小鼠处获取腹股沟脂肪，用PBS洗涤两次以去除红细胞，无菌剪刀剪碎后离心，弃去液体部分。使用高速均质机均质化脂肪组织，依次通过0.25mm和0.15mm不锈钢滤网过滤，3000g离心3min后，分离出的胶原沉淀物即为ACF，用于后续实验。
ACF-MN贴片制备
采用12×12微针阵列的PDMS模具，其微针凹槽中心间距、基底直径、高度和尖端直径分别为1000μm、460μm、1000μm和15μm。将1g Gel-MA和0.1g HA混合并溶解于10ml 0.1%光引发剂中，按不同质量比加入ACF，超声振动分散，取200μl浇铸液加入PDMS模具顶部，真空处理5min、紫外照射2min后，4℃干燥剂干燥5h。随后，向模具中加入200μl含10% PVA（w/v）和20%明胶（w/v）的第二浇铸液，真空处理5min，4℃干燥剂干燥24h。最后，在PDMS模具上放置粘性纸，小心脱模得到ACF-MN贴片，4℃干燥剂保存备用。
ACF-MN贴片相关性能检测
1. 形态学表征：通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察ACF-MN的微观特征，利用ImageJ软件测量其中心间距、高度、基底直径和尖端直径（每组n=10）。
2. 断裂力测试：采用位移力测试站对不同ACF与Gel-MA/HA质量比的ACF-MN进行单轴压缩试验，测定断裂力。
3. 体外皮肤插入实验：选取最优ACF/Gel-MA/HA质量比的ACF-MN贴片，垂直按压到离体小鼠皮肤，分别放置5、10、30、60min后移除。用4%台盼蓝溶液染色10min，10%福尔马林固定皮肤，石蜡包埋切片（4μm）并进行H&E染色，光学显微镜观察剩余ACF-MN贴片，计算插入率（插入率=插入的微针数量/贴片中总微针数量（144）×100%）。
体外抗炎和免疫调节实验
制备小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7），37℃培养至贴壁，更换无血清培养基培养4h，加入LPS刺激炎症因子产生，同时加入不同ACF与Gel-MA/HA质量比的微针贴片，培养48h后收集细胞，超声破碎释放内容物，离心收集上清液，采用ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6水平。
ACF-MN贴片体内应用相关实验
1. 生物安全性评估：将ACF-MN贴片应用于健康BALB/c小鼠背部皮肤，30min后移除，观察7天内皮肤反应。
2. 体内释放实验：向2:1的ACF/Gel-MA/HA溶液中加入5%尼罗红染料（w/v），超声振动混匀，制备荧光ACF-MN贴片，应用于健康BALB/c小鼠背部皮肤30min，通过体内成像系统在0、1、3、7、10天捕获并测量应用部位的荧光面积和强度。
AD小鼠模型制备与治疗
将小鼠分为4组（每组n=6）：正常对照组（无AD诱导）、PBS组（AD诱导+PBS处理）、ACF组（AD诱导+新鲜制备的ACF处理）、ACF-MN组（AD诱导+ACF-MN贴片处理）。采用OVA重复表皮激发建立AD样皮肤损伤模型：6周龄雌性BALB/c小鼠麻醉剃毛后，用3M胶带剥离背部皮肤6次，再用浸有100μg/100μl OVA/生理盐水溶液的无菌纱布致敏，每间隔2周致敏一次，共3轮。在致敏期的第28天和第35天，ACF组和PBS组分别向小鼠背部致敏部位皮内注射0.1ml ACF或PBS，ACF-MN组在相同部位应用ACF-MN贴片30min后移除。第50天，使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪测量小鼠背部皮肤经表皮水分（TEWL）水平，棉签收集皮肤微生物样本，随后处死小鼠，收集背部皮肤，一半于-80℃保存，另一半用10%福尔马林固定备用。
(b) 采用液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS）检测正常对照组（NC）、PBS 组及 ACF 组小鼠皮肤中非硫酸化神经酰胺（NS - 神经酰胺）的组成。
(c) 三组小鼠丝聚蛋白的代表性免疫组化（IHC）染色图像。
(d) 三组小鼠兜甲蛋白的代表性免疫组化（IHC）染色图像。比例尺：上栏 50 微米；下栏 20 微米。
(e) 采用 Image J 软件检测的丝聚蛋白表达水平（n=10，均值 ± 标准差）。
(f) 采用 Image J 软件检测的兜甲蛋白表达水平（n=10，均值 ± 标准差）。
(g) 三组小鼠背部皮肤的经皮水分流失值（TEWL）
AD症状评估与相关检测
1. AD症状严重程度评估：由两名独立研究者对红斑/出血、结痂/抓痕、渗液/糜烂、肿胀/水肿、干燥、苔藓化6项症状进行评分（0=无，3=严重），计算总分平均值。
2. 组织学检查：将固定的皮肤样本石蜡包埋切片（4μm），进行H&E和TB染色，显微镜下观察，ImageJ软件测量表皮厚度（H&E染色切片）和计数肥大细胞浸润数量（TB染色切片，每组10个位点）。
3. RNA-Seq分析：提取NC组、PBS组、ACF组皮肤样本总RNA，纯化后逆转录为cDNA，连接接头后PCR扩增构建文库，Illumina Hiseq 3000平台测序（150bp双端 reads），经数据处理后进行差异表达基因（DEGs）筛选和KEGG富集分析、GSEA分析。
4. qPCR检测：提取皮肤样本RNA，逆转录合成cDNA，采用FastStart Universal SYBR Green Master Mix进行qPCR，以β-肌动蛋白为内参基因，检测IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13、IL-17的相对基因表达水平。
5. 16S靶向扩增子测序：提取皮肤微生物样本总细菌基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因V4区（引物515F和806R），纯化定量后混合，Illumina NovaSeq6000平台测序，进行OTU聚类和分类学分析，比较各组微生物丰富度和属水平物种丰度。
6. LC-MS分析：皮肤样本经DISPASE®酶解分离表皮，提取脂质，采用超高效液相色谱-质谱联用仪分析CER(NS)物种的相对含量。
7. 免疫组织化学（IHC）：皮肤组织切片经封闭后，加入一抗（抗filaggrin、抗loricrin）4℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5h，显微镜下观察。
统计分析
实验数据以均值±标准差（SD）表示，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey检验或Kruskal-Wallis检验，p≤0.05认为具有统计学意义。
实验结论
本研究成功开发了负载ACF的甲基丙烯酰化明胶/透明质酸可溶解微针贴片（ACF-MN），其中ACF与Gel-MA/HA质量比为2:1的ACF-MN具有均匀的形态和足够的物理强度，能够稳定插入皮肤且副作用极小。体内实验表明，ACF-MN贴片与ACF注射类似，可有效缓解AD样皮肤损伤的炎症反应，改善AD临床症状和病理变化，包括减轻表皮增厚、减少肥大细胞浸润等。通过RNA测序结合相关检测技术初步阐明，ACF对AD具有综合效果，其机制涉及调节免疫紊乱（下调炎症相关通路及细胞因子表达）、改善微生物群失衡（增加皮肤微生物多样性、抑制葡萄球菌增殖）以及纠正脂质合成失调（上调脂肪酸合成和延长相关通路，恢复神经酰胺组成，促进皮肤屏障修复）。该ACF-MN贴片有望替代传统ACF注射，成为缓解AD的有前景的给药策略。但本研究的RNA-Seq分析仅为ACF提供了初步见解，未来需进一步探索ACF影响AD的具体通路和基因，优化MN贴片中ACF的剂量。此外，ACF及ACF-MN贴片也可能用于缓解其他具有类似发病机制的炎症性皮肤病（如银屑病、湿疹），尤其是慢性期患者。
摘要
特应性皮炎（AD）是一种慢性复发性皮肤病，亟需新的治疗方法。该研究团队此前研发了一种物理提取的脂肪来源细胞外基质，命名为脂肪胶原片段（ACF），经证实其含有大量与脂肪基质结合的脂肪因子，通过皮内注射对AD具有治疗效果。然而，药物释放控制难题及注射带来的不可避免的疼痛，阻碍了ACF的应用。微针（MN）是一种快速发展的无痛经皮给药技术。因此，本研究开发了一种负载ACF的甲基丙烯酰化明胶/透明质酸可溶解微针贴片。研究评估了ACF-MN的形态特征、机械性能、渗透能力、生物相容性和降解效率，并探究了其对卵清蛋白诱导的AD小鼠的疗效。结果表明，ACF-MN具有优异的渗透能力、生物相容性和降解效率，对小鼠AD的效果与新鲜制备的ACF相当。此外，通过RNA测序结合生物信息学技术探究其作用机制发现，ACF治疗可通过恢复炎症失调、微生物群失衡和皮肤屏障缺陷，对AD发挥综合治疗效果。本研究提供了一种新型的基于微针的ACF结合脂肪因子经皮给药系统，有望成为缓解AD的有效策略。
实验材料与仪器
实验材料
1.实验动物：6周龄雌性BALB/c小鼠。
2.生物材料：脂肪组织、甲基丙烯酰化明胶、透明质酸、光引发剂、聚乙烯醇、明胶、卵清蛋白、脂多糖、 Nile红染料、磷酸盐缓冲液、DISPASE®、各种神经酰胺标准品。
3.试剂盒与试剂：ELISA试剂盒、TRIzol Reagent®、逆转录试剂盒、DNA提取试剂盒、PicoGreen dsDNA检测试剂盒。
4.抗体：抗丝聚蛋白兔多克隆抗体、抗兜甲蛋白兔多克隆抗体 、二抗。
5.染色剂：4%台盼蓝溶液、10%福尔马林、苏木精-伊红（H&E）染色剂、甲苯胺蓝（TB）染色剂。
实验仪器
1.样品制备仪器：高速均质机、聚二甲基硅氧烷模具、真空设备、紫外照射设备、干燥剂、位移力测试站。
2.表征与检测仪器：光学显微镜、扫描电子显微镜、ImageJ软件（NIH）、体内成像系统、ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪、Illumina Hiseq 3000测序平台、Illumina NovaSeq6000测序平台、超高效液相色谱-质谱联用仪、PCR仪、石蜡包埋机、切片机。
实验过程
ACF制备
从6周龄雌性BALB/c小鼠处获取腹股沟脂肪，用PBS洗涤两次以去除红细胞，无菌剪刀剪碎后离心，弃去液体部分。使用高速均质机均质化脂肪组织，依次通过0.25mm和0.15mm不锈钢滤网过滤，3000g离心3min后，分离出的胶原沉淀物即为ACF，用于后续实验。
ACF-MN贴片制备
采用12×12微针阵列的PDMS模具，其微针凹槽中心间距、基底直径、高度和尖端直径分别为1000μm、460μm、1000μm和15μm。将1g Gel-MA和0.1g HA混合并溶解于10ml 0.1%光引发剂中，按不同质量比加入ACF，超声振动分散，取200μl浇铸液加入PDMS模具顶部，真空处理5min、紫外照射2min后，4℃干燥剂干燥5h。随后，向模具中加入200μl含10% PVA（w/v）和20%明胶（w/v）的第二浇铸液，真空处理5min，4℃干燥剂干燥24h。最后，在PDMS模具上放置粘性纸，小心脱模得到ACF-MN贴片，4℃干燥剂保存备用。
ACF-MN贴片相关性能检测
1. 形态学表征：通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察ACF-MN的微观特征，利用ImageJ软件测量其中心间距、高度、基底直径和尖端直径（每组n=10）。
2. 断裂力测试：采用位移力测试站对不同ACF与Gel-MA/HA质量比的ACF-MN进行单轴压缩试验，测定断裂力。
3. 体外皮肤插入实验：选取最优ACF/Gel-MA/HA质量比的ACF-MN贴片，垂直按压到离体小鼠皮肤，分别放置5、10、30、60min后移除。用4%台盼蓝溶液染色10min，10%福尔马林固定皮肤，石蜡包埋切片（4μm）并进行H&E染色，光学显微镜观察剩余ACF-MN贴片，计算插入率（插入率=插入的微针数量/贴片中总微针数量（144）×100%）。
体外抗炎和免疫调节实验
制备小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7），37℃培养至贴壁，更换无血清培养基培养4h，加入LPS刺激炎症因子产生，同时加入不同ACF与Gel-MA/HA质量比的微针贴片，培养48h后收集细胞，超声破碎释放内容物，离心收集上清液，采用ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6水平。
ACF-MN贴片体内应用相关实验
1. 生物安全性评估：将ACF-MN贴片应用于健康BALB/c小鼠背部皮肤，30min后移除，观察7天内皮肤反应。
2. 体内释放实验：向2:1的ACF/Gel-MA/HA溶液中加入5%尼罗红染料（w/v），超声振动混匀，制备荧光ACF-MN贴片，应用于健康BALB/c小鼠背部皮肤30min，通过体内成像系统在0、1、3、7、10天捕获并测量应用部位的荧光面积和强度。
AD小鼠模型制备与治疗
将小鼠分为4组（每组n=6）：正常对照组（无AD诱导）、PBS组（AD诱导+PBS处理）、ACF组（AD诱导+新鲜制备的ACF处理）、ACF-MN组（AD诱导+ACF-MN贴片处理）。采用OVA重复表皮激发建立AD样皮肤损伤模型：6周龄雌性BALB/c小鼠麻醉剃毛后，用3M胶带剥离背部皮肤6次，再用浸有100μg/100μl OVA/生理盐水溶液的无菌纱布致敏，每间隔2周致敏一次，共3轮。在致敏期的第28天和第35天，ACF组和PBS组分别向小鼠背部致敏部位皮内注射0.1ml ACF或PBS，ACF-MN组在相同部位应用ACF-MN贴片30min后移除。第50天，使用ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪测量小鼠背部皮肤经表皮水分（TEWL）水平，棉签收集皮肤微生物样本，随后处死小鼠，收集背部皮肤，一半于-80℃保存，另一半用10%福尔马林固定备用。
ASCH VAPOSCAN经皮水分流失测量仪
ACF 对卵清蛋白诱导的特应性皮炎小鼠皮肤屏障修复能力的评价。
(a) ACF 组与 PBS 组中不饱和脂肪酸生物合成及脂肪酸延长通路的基因集富集分析（GESA）和样本聚类分析。(b) 采用液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MS）检测正常对照组（NC）、PBS 组及 ACF 组小鼠皮肤中非硫酸化神经酰胺（NS - 神经酰胺）的组成。
(c) 三组小鼠丝聚蛋白的代表性免疫组化（IHC）染色图像。
(d) 三组小鼠兜甲蛋白的代表性免疫组化（IHC）染色图像。比例尺：上栏 50 微米；下栏 20 微米。
(e) 采用 Image J 软件检测的丝聚蛋白表达水平（n=10，均值 ± 标准差）。
(f) 采用 Image J 软件检测的兜甲蛋白表达水平（n=10，均值 ± 标准差）。
(g) 三组小鼠背部皮肤的经皮水分流失值（TEWL）
AD症状评估与相关检测
1. AD症状严重程度评估：由两名独立研究者对红斑/出血、结痂/抓痕、渗液/糜烂、肿胀/水肿、干燥、苔藓化6项症状进行评分（0=无，3=严重），计算总分平均值。
2. 组织学检查：将固定的皮肤样本石蜡包埋切片（4μm），进行H&E和TB染色，显微镜下观察，ImageJ软件测量表皮厚度（H&E染色切片）和计数肥大细胞浸润数量（TB染色切片，每组10个位点）。
3. RNA-Seq分析：提取NC组、PBS组、ACF组皮肤样本总RNA，纯化后逆转录为cDNA，连接接头后PCR扩增构建文库，Illumina Hiseq 3000平台测序（150bp双端 reads），经数据处理后进行差异表达基因（DEGs）筛选和KEGG富集分析、GSEA分析。
4. qPCR检测：提取皮肤样本RNA，逆转录合成cDNA，采用FastStart Universal SYBR Green Master Mix进行qPCR，以β-肌动蛋白为内参基因，检测IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13、IL-17的相对基因表达水平。
5. 16S靶向扩增子测序：提取皮肤微生物样本总细菌基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因V4区（引物515F和806R），纯化定量后混合，Illumina NovaSeq6000平台测序，进行OTU聚类和分类学分析，比较各组微生物丰富度和属水平物种丰度。
6. LC-MS分析：皮肤样本经DISPASE®酶解分离表皮，提取脂质，采用超高效液相色谱-质谱联用仪分析CER(NS)物种的相对含量。
7. 免疫组织化学（IHC）：皮肤组织切片经封闭后，加入一抗（抗filaggrin、抗loricrin）4℃孵育过夜，二抗室温孵育1.5h，显微镜下观察。
统计分析
实验数据以均值±标准差（SD）表示，采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey检验或Kruskal-Wallis检验，p≤0.05认为具有统计学意义。
实验结论
本研究成功开发了负载ACF的甲基丙烯酰化明胶/透明质酸可溶解微针贴片（ACF-MN），其中ACF与Gel-MA/HA质量比为2:1的ACF-MN具有均匀的形态和足够的物理强度，能够稳定插入皮肤且副作用极小。体内实验表明，ACF-MN贴片与ACF注射类似，可有效缓解AD样皮肤损伤的炎症反应，改善AD临床症状和病理变化，包括减轻表皮增厚、减少肥大细胞浸润等。通过RNA测序结合相关检测技术初步阐明，ACF对AD具有综合效果，其机制涉及调节免疫紊乱（下调炎症相关通路及细胞因子表达）、改善微生物群失衡（增加皮肤微生物多样性、抑制葡萄球菌增殖）以及纠正脂质合成失调（上调脂肪酸合成和延长相关通路，恢复神经酰胺组成，促进皮肤屏障修复）。该ACF-MN贴片有望替代传统ACF注射，成为缓解AD的有前景的给药策略。但本研究的RNA-Seq分析仅为ACF提供了初步见解，未来需进一步探索ACF影响AD的具体通路和基因，优化MN贴片中ACF的剂量。此外，ACF及ACF-MN贴片也可能用于缓解其他具有类似发病机制的炎症性皮肤病（如银屑病、湿疹），尤其是慢性期患者。
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