肉类颜色测量指南之肉色研究方法K-P
2025-12-13 来源:本站 点击次数:52
K.骨骼肌提取物对肌红蛋白的还原作用
原则
肌红蛋白还原酶活性通过监测MMb还原为DMb的过程来测定，随后在有氧体系中快速生成OMb。
酶活性的计算依据是反应初始线性阶段（1至2分钟）期间OMb在580 nm波长处吸光度的增加。
操作步骤
1. 取5克（称重至0.1克）不含可见脂肪或结缔组织的肌肉组织样本，将其切成小块。
2. 将样品在20 mL的0.2 mM磷酸钠缓冲液（pH 5.6）中均质化（或肌肉的pH值)持续90秒，或直至肌肉组织完全破坏。
3. 在 4°C 下使用Beckman超速离心机以35,000× g 离心30分钟。
4. 将上清液倒入小烧杯中，用0.4微米注射器滤器过滤2-3 mL，转移至小试管中。
5. 配制试验溶液：
5 mM EDTA二钠
50 mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.65（将此pH调整至所需pH）
3.0 mM铁氰化钾
0.75 mM甲基肌红蛋白（马骨骼肌来源，货号Sigma M-0630，或经纯化处理的猪/牛来源，
详见纯化方案）溶于30 mM磷酸钠缓冲液
1.0 mM NADH（Sigma N-8129）
6. 打开日立UV-2010分光光度计并预热10分钟。
7. 如果可能，加载一个分光光度法软件程序， 该程序可在180至240秒内测量580 nm处的吸光
度增加 ； 否则手动加载软件 。
8. 将空比色皿放入分光光度计比色皿中，并将仪器归零。
9. 向塑料微孔板中加入以下试剂量：
100 µL 5 mM EDTA
100 µL 50 mM柠檬酸盐缓冲液
100 µL 3.0 mM铁氰化钾
200 0.75 mM甲基肌红蛋白的 µL 值
200 µL 去离子水
10. 将每个微量比色皿放入分光光度计比色皿中，同时加入
100 1 mM NADH的 µL 值
200 µL 过滤后的肌肉提取物
11. 用移液管充分混匀，然后至少释放两次溶液。
注意：加入试剂并尽快混合，因为反应会立即开始。
12. 尽快开始在580 nm处测量吸光度增加，并持续进行
180至240秒。随着肌红蛋白被肌肉提取物还原，吸光度在580 nm会增加。
14. 肌红蛋白还原酶活性的表达方式为：在时间进程的初始线性阶段（通常为 第一或前
两分钟），每分钟每克肌肉中还原的肌红蛋白纳摩尔数。
样例
如果0秒时580 nm处的吸光度为0,60秒时吸光度为0.132，则 Δ Abs580nm= 0.132/分钟。使用比尔定律计算 甲基肌红蛋白到氧合肌红蛋白 的浓度变化。
A = Ebc，其中
A=吸光度（或吸光度变化）
b=路径长度（塑料微孔板为1 cm）
E=消光系数（12000）C = 浓度（mol/L） / 升 0.132=12000×1×c
c = 0.132/12000
c = 11.0 × e-6 M/分钟/5克肌肉或11 µM /分钟/5克肌肉
记下
记住，这里说的是浓度变化，而不是浓度本身。
将浓度变化乘以比色皿中的体积，即可将浓度换算为摩尔。
11 e-6 mol/L/分钟/5克 × 0.0015升 =
16.5×10^-9摩尔/分钟/5克肌肉=
16.5 nmol每分钟/5克肌肉=
3.3 nmol/分钟/克肌肉
每分钟每克肌红蛋白的还原量为3.3 nmol，即为报告数值
记下
如果将吸光度的变化取120秒（2分钟）的平均值，然后将最终数值 除以2 。
参考文献
Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌红蛋白还原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影响牛肉肌肉的颜色、高铁肌红蛋白还原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通过近红外血氧测定法检测三种后强直期骨骼肌中肌红蛋白的氧化还原形态。Food Chem. 123 ：456—464。
L.检测变性血红蛋白血色素的反射率
原则
变性珠蛋白血红素色素的存在可通过528和558纳米处的反射峰来判断（Ghorpade和Cornfor
th，1993）。
材料和设备
1. 白色标准品（硫酸钡粉末）
2. 配备样品和标准品接口的记录型分光光度计及积分球附件。
3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。
操作步骤
1. 使用白色标准品（粉状硫酸钡）在样品和标准 端口的反射附件中，将记录分光光度计的反射率从420至700nm标准化为100%。
2. 获得3 cm × 3 cm的均匀肉片（足以完全覆盖反射附件上的样品端口），厚度>3 mm。
3. 为排除空气和减少褪色，将新鲜切片迅速放入透明聚乙烯 真空袋（厚度 1 . 5mil）中。 从底部向上压紧袋子以 消除气泡。 测量反射率时 ，样品仍留在透明聚乙烯袋中。
4. 将装袋样品紧密放入反射率球的样品口，使新鲜切片的表面朝内（即朝向检测器）。记录420至700纳米波长范围内的表面反射率（以标准值百分比表示）。变性珠蛋白血红素色素的存在可通过528和558纳米附近出现反射率峰值来判断（戈尔帕德和康福斯 ， 1986 ； 康福斯 ， 2001）。
5. 可选:若需获取新鲜样本与褪色样本的差异光谱,可将对照组肉片置于空气中褪色15至30分钟。
6. 将样品装入袋中，按新鲜样品的描述记录反射光谱。
7. 从新鲜样本光谱中减去基线光谱（褪色切片）。
参考文献
Cornforth，D. P. 2001. 熟肉与腌制肉色素的分光光度法及反射率测定。收录于《食品分析化学最新实验指南》F3.2单元，由S. J. Schwartz主编，John Wiley and Sons Inc.出版社，纽约。
Ghorpade，V. M.和D. P. Cornforth. 1993 .在65°C或82°C下烹制的猪肉烤制过程中产生粉红色的色素的光谱。J. Food Sci. 58：51-52,59。
M. nitrite熟肉分析
原则
亚硝酸盐离子被溶入热水中。取部分提取液与格里斯试剂（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成最大吸光度为540 nm的粉红色偶氮染料。 粉红色调的深浅 与 初始亚硝酸盐浓度（按比尔定律）成正比。 样品亚硝酸盐浓度通过亚硝酸盐标准曲线计算 ，并考虑样品稀释倍数。
试剂和仪器
1. NED试剂：将0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要时过
滤，储存在棕色玻璃瓶中。
2. 磺胺试剂：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（体积分数）乙酸中，必要时过滤，置于棕色
玻璃瓶中保存。
3. 亚硝酸盐标准：
a. 贮备液：亚硝酸钠1000ppm。取亚硝酸钠1.0g溶于水，稀释至1L。
b. 中间溶液：100 ppm亚硝酸钠。取100 mL原液，加水稀释至1 L。
c. 工作溶液：1 ppm亚硝酸钠。取10 mL中间体溶液，用水稀释至1 L。
4. 取3-4张滤纸，分析盒中滤纸的亚硝酸盐污染情况。 通过每张滤纸过滤约40mL水 。 加入4mL磺胺类试剂，搅拌，静置5分钟，加入4毫升NED试剂，混合后静置15分钟。若检测到阳性结果，请丢弃整盒。
操作步骤
1. 称取5克细碎组织，将样本充分混匀后置于50毫升烧杯中。
2. 加入约40mL80℃水，用玻璃棒充分混匀，破碎所有块状物， 并转移至500 - mL容量瓶中。
3. 用热水分次清洗烧杯和棒，将所有洗液倒入烧瓶中。
4. 加入足量热水，使体积达到约300mL，将烧瓶转移至80°C 水浴 中，并静置2小时，偶尔摇动。
5. 冷却至室温，用水稀释至体积，并再次混合。
6. 过滤，向50-50mL容量瓶中含5至50µg亚硝酸钠的等分试样中加入2.5mL磺胺类试剂，并混合。
7. 5分钟后，加入2.5 mL NED试剂，混合，稀释至体积，再次混合， 15分钟内显色 。
8. 将溶液转移至分光光度计比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺类试剂和2.5mLNED试剂的空白溶液为对照，测定 540nm 处的吸光度。
9. 制备标准曲线：向50毫升容量瓶中分别加入10、20、30和40毫升工作硝酸钠溶液，加入2.5毫升磺胺类试剂，混匀后按上述步骤进行，从步骤7开始。最终溶液中硝酸钠浓度为1ppm时，标准曲线呈直线。
计算
样品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g样品）=标准曲线给出的ppm NaNO2×50/分装量（mL）×500/样品重量(g)
参考
AOAC . 1990. 《熟肉中亚硝酸盐的测定方法973.31》，载于《官方分析方法》第15版，K. Helrich主编，弗吉尼亚州阿灵顿： AOAC 出版社，第938页。
n. 烤肉及配料的硝酸盐分析
原则
亚硝酸盐和硝酸盐离子需用热水提取。
初始亚硝酸盐浓度通过与格里斯试剂反应后产生的粉红色（540nm 波长）强度测定，具体方法如先前所述。测定硝酸盐+亚硝酸盐时，将样品提取液与钒（III）溶液+格里斯试剂混合孵育。
酸性溶液中的钒可将所有硝酸盐离子还原为亚硝酸盐。随着亚硝酸盐生成，其会与预先存在的亚硝酸盐一同被格里斯试剂捕获。
硝酸盐浓度=总亚硝酸盐（钒测定法中硝酸盐+亚硝酸盐的总和）-初始亚硝酸盐。
该方法经过改良，将钒+格里斯试剂合并为单一溶液，并改用分光光度计比色皿进行检测。
程序（NEMI ，2011）
1. 将约200 mL 0.5 M盐酸倒入一个小瓶中。
2. 将瓶子置于带通风罩的天平上，直接称取约0.5g三氯化钒（III）放入瓶中（为避免其粘附在铲
子、称量器等上）。如果仍有未溶解的颗粒残留，通过>2微米注射器过滤器进行过滤。
3. 加入约0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NED）并溶解。
记下
将打开的VCl瓶 3 放置在无水硫酸钙等干燥剂上。VCl在潮湿空气中会 3 释放腐蚀性气体，但在试剂中溶解后 将不再释放气体。 氯化钒不被归类为有毒或对环境有害（MSDS 数据），与旧方法中使用的镉不同。
VCl 3 + Greiss试剂溶液冷藏可保存约一周，但对空气和光线敏感，若在室温下放置数日且未加盖，易被氧化。
将以下体积的样品和试剂直接混合在半微量比色皿中，或按所用仪器的细胞大小进行比例调整。
对于1至20ppm（µg /mL）硝酸盐氮，将20 µ L样品与1000 µL 试剂混合。
对于1至10ppm硝酸盐氮，使用45 µL 样品和1000 µL 试剂。
当硝酸盐氮含量低于1 ppm时，使用500 µL 样品和500 µL 试剂（注：1,000 µL =1 mL）。
（如果新批次样品的浓度完全未知，可通过筛选几个代表性样品快速估计其浓度范围。将等量样品与试剂混合。对几个标准品也做同样的处理。在烘箱或热水下对样品进行短暂加热 。通过比较颜色来决定最佳浓度范围。）
将样品移入半微量比色皿，随后向所有比色皿中加入试剂。盖上盖子，轻轻倒置以充分混合。
样品需在室温（20-25℃）条件下保存。显色反应在4-5小时后逐渐减弱，6-10小时后达到峰值。比色测定需以试剂空白（水）为对照，在 540nm 波长下进行。建议将标准品与样品共同分析，以便建立校准曲线用于浓度计算。虽然4-5小时后即可进行测量，但为确保准确性，建议次日制备样品并测定吸光度。
颜色可能可在60 ℃ 下约2小时内显色， 或将样品混合于小试管中 ，在约100℃下加热10至15分钟，使颜色完全显色。
肉类样品的制备采用与亚硝酸盐测定相同的热水萃取法。计算硝酸盐/亚硝酸盐浓度时，需考虑样
品的稀释倍数。
该方法经过轻微调整，具体说明可参见 NEMI 官网（NEMI ，2011）。
参考文献
多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用单一试剂测定硝酸盐的分光光度法。分析。
Lett .36：2713—2722。
NEMI（国家环境方法索引）。2011。国家环境方法索引。2011。 https:// www.nemi.gov/ 。
o. t BARS氧化酸败检测法——快速湿法
原则
在硫代巴比妥酸（TBA）存在下，丙二醛和脂质氧化的其他醛类产物（TBA反应物质； TBARS）会形成 粉色显色剂，其最大吸收峰位于532至535 nm 。 然而 ， 在干扰性糖类存在时 ， 会形成黄色显色剂 ， 采用Tarladgis（1960）蒸馏法 可避免此现象。
试剂
1. TBA贮备液：0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 N 盐酸 。
2. 100mL贮备液足以进行20次单独检测。贮备液可在室温下避光保存（封装于铝箔包装容器中）。
操作步骤
1. 将目标产物切碎或绞碎，称取两份0.5克样品。
2. 向每个样品中加入2.5 mL TBA贮备液，使稀释倍数为6。混匀。
3. 将样品置于沸水中加热10分钟，使用松盖试管（圆底Pyrex 或聚丙烯离心管）。 注意： 密封盖试管在加热过程中可能爆裂。加热过程中阳性样品会变成粉色。
4. 用自来水冷却试管。
5. 在4 °C 下以5000× g 离心10分钟，获得澄清上清液。
6. 小心地将上清液的一部分移至分光光度计比色皿中，注意溶液保持澄清。
7. 在532 nm处测定上清液吸光度，空白对照为 含有所有试剂 ， 但不含肉的溶液。
8. 使用 粉色TBA显色剂的消光系数 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu1958），
计算以ppm丙二醛表示的TBA值 ， 具体方法如下 ：
TBARS数值（mg MDA/kg）=样品A532×（1M TBA显色剂/156，000）×[（1mol/L/M]×（0.003L/0.5g肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，
或TBARS 值（ppm）= 样品A A 532 ×2.77 。
参考文献
Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒体脂质过氧化.方法酶学.52： 302 — 304 .
Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 鱼类制品酸败度的硫代巴比妥酸法测定 .II.丙二醛的定量测定.食品技术.12：9—12.
P.t BARS氧化酸败检测法——蒸馏法
原则
该方法中，将样品置于水中加热，通过蒸汽蒸馏收集挥发性丙二醛及其他TBA反应物（TBARS）。向 蒸馏液等分试样中加入TBA溶液，形成粉红色TBA显色剂 ， 通过分光光度法进行定（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。
解决方案
1. TBA试剂：将1.44 g2-硫代巴比妥酸（分子量144.1）溶于450 mL 冰醋酸 中。 用50 - mL容量瓶定容。 搅拌后，置于暗处（用铝箔包装）保存。
2. 磺胺试剂：将1克磺胺溶解于含有40毫升浓盐酸和160毫升蒸馏水的溶液中。
操作步骤
1. 将10克绞碎或切碎的肉样与50毫升蒸馏水混合，使用Waring搅拌器。定量转移至圆底加热瓶（凯氏瓶），并添加47.5毫升额外水。加入2.5毫升6 N 盐酸溶液（1,2浓缩盐酸与水混合）。
2. 为防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加热时起泡，可加入消泡剂（如陶氏H-10消泡剂或同类产品）。
3. 将烧瓶充分加热以产生蒸汽。使用水冷凝蒸馏装置，将50mL蒸馏液收集到量筒中。每份样品所需时间约为10分钟。
4. 将蒸馏液充分混匀，用移液管吸取5mL注入50mL带塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 试剂 。
5. 与由5mL蒸馏水和5mLTBA试剂组成的空白混合后，将其与空白一起浸入沸水浴中，精确浸泡35分钟。
6. 将冷却后的样品瓶置于自来水下静置10分钟。使用零点校准的分光光度计，在538 nm处测定吸光度，以TBA-水空白为对照。
参考文献
Koniecko，E. S. 1979. 《肉类化学家手册》，第53、54和62页。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。
塞弗特，M.，M.C.亨特，J.P.格罗贝尔，S.M.瑞安，D.E.约翰逊，和R.A.莫德伦.2006.乳酸钾和新鲜猪肉香肠配方对有光和无光展示货架寿命的影响。J.Food Sci.71：C390–C394.
塔拉德吉斯、B.G.、B.M.沃茨和M.T.尤纳森，1960年。《用于定量测定变质食品中丙二醛的蒸馏法》，载于《美国油脂化学学会杂志》第37卷第44–48页。
原则
肌红蛋白还原酶活性通过监测MMb还原为DMb的过程来测定，随后在有氧体系中快速生成OMb。
酶活性的计算依据是反应初始线性阶段（1至2分钟）期间OMb在580 nm波长处吸光度的增加。
操作步骤
1. 取5克（称重至0.1克）不含可见脂肪或结缔组织的肌肉组织样本，将其切成小块。
2. 将样品在20 mL的0.2 mM磷酸钠缓冲液（pH 5.6）中均质化（或肌肉的pH值)持续90秒，或直至肌肉组织完全破坏。
3. 在 4°C 下使用Beckman超速离心机以35,000× g 离心30分钟。
4. 将上清液倒入小烧杯中，用0.4微米注射器滤器过滤2-3 mL，转移至小试管中。
5. 配制试验溶液：
5 mM EDTA二钠
50 mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.65（将此pH调整至所需pH）
3.0 mM铁氰化钾
0.75 mM甲基肌红蛋白（马骨骼肌来源，货号Sigma M-0630，或经纯化处理的猪/牛来源，
详见纯化方案）溶于30 mM磷酸钠缓冲液
1.0 mM NADH（Sigma N-8129）
6. 打开日立UV-2010分光光度计并预热10分钟。
7. 如果可能，加载一个分光光度法软件程序， 该程序可在180至240秒内测量580 nm处的吸光
度增加 ； 否则手动加载软件 。
8. 将空比色皿放入分光光度计比色皿中，并将仪器归零。
9. 向塑料微孔板中加入以下试剂量：
100 µL 5 mM EDTA
100 µL 50 mM柠檬酸盐缓冲液
100 µL 3.0 mM铁氰化钾
200 0.75 mM甲基肌红蛋白的 µL 值
200 µL 去离子水
10. 将每个微量比色皿放入分光光度计比色皿中，同时加入
100 1 mM NADH的 µL 值
200 µL 过滤后的肌肉提取物
11. 用移液管充分混匀，然后至少释放两次溶液。
注意：加入试剂并尽快混合，因为反应会立即开始。
12. 尽快开始在580 nm处测量吸光度增加，并持续进行
180至240秒。随着肌红蛋白被肌肉提取物还原，吸光度在580 nm会增加。
14. 肌红蛋白还原酶活性的表达方式为：在时间进程的初始线性阶段（通常为 第一或前
两分钟），每分钟每克肌肉中还原的肌红蛋白纳摩尔数。
样例
如果0秒时580 nm处的吸光度为0,60秒时吸光度为0.132，则 Δ Abs580nm= 0.132/分钟。使用比尔定律计算 甲基肌红蛋白到氧合肌红蛋白 的浓度变化。
A = Ebc，其中
A=吸光度（或吸光度变化）
b=路径长度（塑料微孔板为1 cm）
E=消光系数（12000）C = 浓度（mol/L） / 升 0.132=12000×1×c
c = 0.132/12000
c = 11.0 × e-6 M/分钟/5克肌肉或11 µM /分钟/5克肌肉
记下
记住，这里说的是浓度变化，而不是浓度本身。
将浓度变化乘以比色皿中的体积，即可将浓度换算为摩尔。
11 e-6 mol/L/分钟/5克 × 0.0015升 =
16.5×10^-9摩尔/分钟/5克肌肉=
16.5 nmol每分钟/5克肌肉=
3.3 nmol/分钟/克肌肉
每分钟每克肌红蛋白的还原量为3.3 nmol，即为报告数值
记下
如果将吸光度的变化取120秒（2分钟）的平均值，然后将最终数值 除以2 。
参考文献
Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌红蛋白还原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影响牛肉肌肉的颜色、高铁肌红蛋白还原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通过近红外血氧测定法检测三种后强直期骨骼肌中肌红蛋白的氧化还原形态。Food Chem. 123 ：456—464。
L.检测变性血红蛋白血色素的反射率
原则
变性珠蛋白血红素色素的存在可通过528和558纳米处的反射峰来判断（Ghorpade和Cornfor
th，1993）。
材料和设备
1. 白色标准品（硫酸钡粉末）
2. 配备样品和标准品接口的记录型分光光度计及积分球附件。
3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。
操作步骤
1. 使用白色标准品（粉状硫酸钡）在样品和标准 端口的反射附件中，将记录分光光度计的反射率从420至700nm标准化为100%。
2. 获得3 cm × 3 cm的均匀肉片（足以完全覆盖反射附件上的样品端口），厚度>3 mm。
3. 为排除空气和减少褪色，将新鲜切片迅速放入透明聚乙烯 真空袋（厚度 1 . 5mil）中。 从底部向上压紧袋子以 消除气泡。 测量反射率时 ，样品仍留在透明聚乙烯袋中。
4. 将装袋样品紧密放入反射率球的样品口，使新鲜切片的表面朝内（即朝向检测器）。记录420至700纳米波长范围内的表面反射率（以标准值百分比表示）。变性珠蛋白血红素色素的存在可通过528和558纳米附近出现反射率峰值来判断（戈尔帕德和康福斯 ， 1986 ； 康福斯 ， 2001）。
5. 可选:若需获取新鲜样本与褪色样本的差异光谱,可将对照组肉片置于空气中褪色15至30分钟。
6. 将样品装入袋中，按新鲜样品的描述记录反射光谱。
7. 从新鲜样本光谱中减去基线光谱（褪色切片）。
参考文献
Cornforth，D. P. 2001. 熟肉与腌制肉色素的分光光度法及反射率测定。收录于《食品分析化学最新实验指南》F3.2单元，由S. J. Schwartz主编，John Wiley and Sons Inc.出版社，纽约。
Ghorpade，V. M.和D. P. Cornforth. 1993 .在65°C或82°C下烹制的猪肉烤制过程中产生粉红色的色素的光谱。J. Food Sci. 58：51-52,59。
M. nitrite熟肉分析
原则
亚硝酸盐离子被溶入热水中。取部分提取液与格里斯试剂（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成最大吸光度为540 nm的粉红色偶氮染料。 粉红色调的深浅 与 初始亚硝酸盐浓度（按比尔定律）成正比。 样品亚硝酸盐浓度通过亚硝酸盐标准曲线计算 ，并考虑样品稀释倍数。
试剂和仪器
1. NED试剂：将0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要时过
滤，储存在棕色玻璃瓶中。
2. 磺胺试剂：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（体积分数）乙酸中，必要时过滤，置于棕色
玻璃瓶中保存。
3. 亚硝酸盐标准：
a. 贮备液：亚硝酸钠1000ppm。取亚硝酸钠1.0g溶于水，稀释至1L。
b. 中间溶液：100 ppm亚硝酸钠。取100 mL原液，加水稀释至1 L。
c. 工作溶液：1 ppm亚硝酸钠。取10 mL中间体溶液，用水稀释至1 L。
4. 取3-4张滤纸，分析盒中滤纸的亚硝酸盐污染情况。 通过每张滤纸过滤约40mL水 。 加入4mL磺胺类试剂，搅拌，静置5分钟，加入4毫升NED试剂，混合后静置15分钟。若检测到阳性结果，请丢弃整盒。
操作步骤
1. 称取5克细碎组织，将样本充分混匀后置于50毫升烧杯中。
2. 加入约40mL80℃水，用玻璃棒充分混匀，破碎所有块状物， 并转移至500 - mL容量瓶中。
3. 用热水分次清洗烧杯和棒，将所有洗液倒入烧瓶中。
4. 加入足量热水，使体积达到约300mL，将烧瓶转移至80°C 水浴 中，并静置2小时，偶尔摇动。
5. 冷却至室温，用水稀释至体积，并再次混合。
6. 过滤，向50-50mL容量瓶中含5至50µg亚硝酸钠的等分试样中加入2.5mL磺胺类试剂，并混合。
7. 5分钟后，加入2.5 mL NED试剂，混合，稀释至体积，再次混合， 15分钟内显色 。
8. 将溶液转移至分光光度计比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺类试剂和2.5mLNED试剂的空白溶液为对照，测定 540nm 处的吸光度。
9. 制备标准曲线：向50毫升容量瓶中分别加入10、20、30和40毫升工作硝酸钠溶液，加入2.5毫升磺胺类试剂，混匀后按上述步骤进行，从步骤7开始。最终溶液中硝酸钠浓度为1ppm时，标准曲线呈直线。
计算
样品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g样品）=标准曲线给出的ppm NaNO2×50/分装量（mL）×500/样品重量(g)
参考
AOAC . 1990. 《熟肉中亚硝酸盐的测定方法973.31》，载于《官方分析方法》第15版，K. Helrich主编，弗吉尼亚州阿灵顿： AOAC 出版社，第938页。
n. 烤肉及配料的硝酸盐分析
原则
亚硝酸盐和硝酸盐离子需用热水提取。
初始亚硝酸盐浓度通过与格里斯试剂反应后产生的粉红色（540nm 波长）强度测定，具体方法如先前所述。测定硝酸盐+亚硝酸盐时，将样品提取液与钒（III）溶液+格里斯试剂混合孵育。
酸性溶液中的钒可将所有硝酸盐离子还原为亚硝酸盐。随着亚硝酸盐生成，其会与预先存在的亚硝酸盐一同被格里斯试剂捕获。
硝酸盐浓度=总亚硝酸盐（钒测定法中硝酸盐+亚硝酸盐的总和）-初始亚硝酸盐。
该方法经过改良，将钒+格里斯试剂合并为单一溶液，并改用分光光度计比色皿进行检测。
程序（NEMI ，2011）
1. 将约200 mL 0.5 M盐酸倒入一个小瓶中。
2. 将瓶子置于带通风罩的天平上，直接称取约0.5g三氯化钒（III）放入瓶中（为避免其粘附在铲
子、称量器等上）。如果仍有未溶解的颗粒残留，通过>2微米注射器过滤器进行过滤。
3. 加入约0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NED）并溶解。
记下
将打开的VCl瓶 3 放置在无水硫酸钙等干燥剂上。VCl在潮湿空气中会 3 释放腐蚀性气体，但在试剂中溶解后 将不再释放气体。 氯化钒不被归类为有毒或对环境有害（MSDS 数据），与旧方法中使用的镉不同。
VCl 3 + Greiss试剂溶液冷藏可保存约一周，但对空气和光线敏感，若在室温下放置数日且未加盖，易被氧化。
将以下体积的样品和试剂直接混合在半微量比色皿中，或按所用仪器的细胞大小进行比例调整。
对于1至20ppm（µg /mL）硝酸盐氮，将20 µ L样品与1000 µL 试剂混合。
对于1至10ppm硝酸盐氮，使用45 µL 样品和1000 µL 试剂。
当硝酸盐氮含量低于1 ppm时，使用500 µL 样品和500 µL 试剂（注：1,000 µL =1 mL）。
（如果新批次样品的浓度完全未知，可通过筛选几个代表性样品快速估计其浓度范围。将等量样品与试剂混合。对几个标准品也做同样的处理。在烘箱或热水下对样品进行短暂加热 。通过比较颜色来决定最佳浓度范围。）
将样品移入半微量比色皿，随后向所有比色皿中加入试剂。盖上盖子，轻轻倒置以充分混合。
样品需在室温（20-25℃）条件下保存。显色反应在4-5小时后逐渐减弱，6-10小时后达到峰值。比色测定需以试剂空白（水）为对照，在 540nm 波长下进行。建议将标准品与样品共同分析，以便建立校准曲线用于浓度计算。虽然4-5小时后即可进行测量，但为确保准确性，建议次日制备样品并测定吸光度。
颜色可能可在60 ℃ 下约2小时内显色， 或将样品混合于小试管中 ，在约100℃下加热10至15分钟，使颜色完全显色。
肉类样品的制备采用与亚硝酸盐测定相同的热水萃取法。计算硝酸盐/亚硝酸盐浓度时，需考虑样
品的稀释倍数。
该方法经过轻微调整，具体说明可参见 NEMI 官网（NEMI ，2011）。
参考文献
多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用单一试剂测定硝酸盐的分光光度法。分析。
Lett .36：2713—2722。
NEMI（国家环境方法索引）。2011。国家环境方法索引。2011。 https:// www.nemi.gov/ 。
o. t BARS氧化酸败检测法——快速湿法
原则
在硫代巴比妥酸（TBA）存在下，丙二醛和脂质氧化的其他醛类产物（TBA反应物质； TBARS）会形成 粉色显色剂，其最大吸收峰位于532至535 nm 。 然而 ， 在干扰性糖类存在时 ， 会形成黄色显色剂 ， 采用Tarladgis（1960）蒸馏法 可避免此现象。
试剂
1. TBA贮备液：0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 N 盐酸 。
2. 100mL贮备液足以进行20次单独检测。贮备液可在室温下避光保存（封装于铝箔包装容器中）。
操作步骤
1. 将目标产物切碎或绞碎，称取两份0.5克样品。
2. 向每个样品中加入2.5 mL TBA贮备液，使稀释倍数为6。混匀。
3. 将样品置于沸水中加热10分钟，使用松盖试管（圆底Pyrex 或聚丙烯离心管）。 注意： 密封盖试管在加热过程中可能爆裂。加热过程中阳性样品会变成粉色。
4. 用自来水冷却试管。
5. 在4 °C 下以5000× g 离心10分钟，获得澄清上清液。
6. 小心地将上清液的一部分移至分光光度计比色皿中，注意溶液保持澄清。
7. 在532 nm处测定上清液吸光度，空白对照为 含有所有试剂 ， 但不含肉的溶液。
8. 使用 粉色TBA显色剂的消光系数 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu1958），
计算以ppm丙二醛表示的TBA值 ， 具体方法如下 ：
TBARS数值（mg MDA/kg）=样品A532×（1M TBA显色剂/156，000）×[（1mol/L/M]×（0.003L/0.5g肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，
或TBARS 值（ppm）= 样品A A 532 ×2.77 。
参考文献
Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒体脂质过氧化.方法酶学.52： 302 — 304 .
Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 鱼类制品酸败度的硫代巴比妥酸法测定 .II.丙二醛的定量测定.食品技术.12：9—12.
P.t BARS氧化酸败检测法——蒸馏法
原则
该方法中，将样品置于水中加热，通过蒸汽蒸馏收集挥发性丙二醛及其他TBA反应物（TBARS）。向 蒸馏液等分试样中加入TBA溶液，形成粉红色TBA显色剂 ， 通过分光光度法进行定（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。
解决方案
1. TBA试剂：将1.44 g2-硫代巴比妥酸（分子量144.1）溶于450 mL 冰醋酸 中。 用50 - mL容量瓶定容。 搅拌后，置于暗处（用铝箔包装）保存。
2. 磺胺试剂：将1克磺胺溶解于含有40毫升浓盐酸和160毫升蒸馏水的溶液中。
操作步骤
1. 将10克绞碎或切碎的肉样与50毫升蒸馏水混合，使用Waring搅拌器。定量转移至圆底加热瓶（凯氏瓶），并添加47.5毫升额外水。加入2.5毫升6 N 盐酸溶液（1,2浓缩盐酸与水混合）。
2. 为防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加热时起泡，可加入消泡剂（如陶氏H-10消泡剂或同类产品）。
3. 将烧瓶充分加热以产生蒸汽。使用水冷凝蒸馏装置，将50mL蒸馏液收集到量筒中。每份样品所需时间约为10分钟。
4. 将蒸馏液充分混匀，用移液管吸取5mL注入50mL带塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 试剂 。
5. 与由5mL蒸馏水和5mLTBA试剂组成的空白混合后，将其与空白一起浸入沸水浴中，精确浸泡35分钟。
6. 将冷却后的样品瓶置于自来水下静置10分钟。使用零点校准的分光光度计，在538 nm处测定吸光度，以TBA-水空白为对照。
参考文献
Koniecko，E. S. 1979. 《肉类化学家手册》，第53、54和62页。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。
塞弗特，M.，M.C.亨特，J.P.格罗贝尔，S.M.瑞安，D.E.约翰逊，和R.A.莫德伦.2006.乳酸钾和新鲜猪肉香肠配方对有光和无光展示货架寿命的影响。J.Food Sci.71：C390–C394.
塔拉德吉斯、B.G.、B.M.沃茨和M.T.尤纳森，1960年。《用于定量测定变质食品中丙二醛的蒸馏法》，载于《美国油脂化学学会杂志》第37卷第44–48页。
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