在一细胞中实现多基因共表达的方法策略
2025-12-16 来源:本站 点击次数:49
当细胞中需要表达多个基因时，可以选择使用双顺反子或多顺反子表达载体。在构建双顺反子或多顺反子 载体的各种策略中，来源于脑心肌炎病毒 EMCV 的内部核糖体进入位点 (internal ribosome entry site， IRES) 或来源于口蹄疫病毒 FMCV 的自剪切多肽 2A(self-cleaving 2A peptide，2A) 被广泛应用，实现了 在单个载体上同时表达多个基因的目的。
◆内部核糖体进入位点 IRES
IRES 能够在一些反式作用因子的辅助下，招募核糖体小亚基到 mRNA 的翻译起始位点，使蛋白质翻译起 始不依赖于 5′帽结构，从而使核糖体直接从 mRNA 中间起始翻译成为可能，即允许在同一启动子的控制 下共同表达多个基因。绝大多数细胞 IRES 元件位于起始密码子上游的 5′ UTR 内。然而，在有些情况下， IRES 位于起始密码子的下游或位于编码区，从而触发截短蛋白的合成。携带有 IRES 元件的双顺反子或多 顺反子 rAAV 载体可用于由同一启动子控制的多个基因的共同表达。需要强调的是，IRES 下游基因的有效 表达依赖于特定的 IRES 序列，因此，保证 IRES 基因序列的完整性对于其高效活性至关重要。
IRES 的优点：确保了 IRES 上下游基因的共表达；在 IRES 下游加入亚细胞定位等序列的可行性；
◆自剪切多肽 2A
自剪切多肽 2A 于 1991 年在口蹄疫病毒（FMDV）中被发现，平均长度为 18-22 个氨基酸，位于小 核糖核酸病毒家族成员的两种蛋白质之间。目前，主要有 4 种常用的 2A 肽，分别来源于口蹄疫病毒 2A(F2A)、1 型猪捷申病毒 2A (P2A)、明脉扁刺蛾病毒 2A (T2A)、马甲型鼻炎病毒 2A (E2A)，序列如下：
F2A:VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG
P2A:GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
T2A: EGRGSLLTCGDVEENPG
E2A:QCTNYALLKLAGDVESNPG
2A 肽的优点：结构小，缓解了载体装载量的压力，也为联合应用多种工具构建三个及以上顺反子提供了 可能；上下游蛋白表达均衡；基于 2A 肽的双顺反子载体比基于 IRES 的载体更有效。
◆内部核糖体进入位点 IRES
IRES 能够在一些反式作用因子的辅助下，招募核糖体小亚基到 mRNA 的翻译起始位点，使蛋白质翻译起 始不依赖于 5′帽结构，从而使核糖体直接从 mRNA 中间起始翻译成为可能，即允许在同一启动子的控制 下共同表达多个基因。绝大多数细胞 IRES 元件位于起始密码子上游的 5′ UTR 内。然而，在有些情况下， IRES 位于起始密码子的下游或位于编码区，从而触发截短蛋白的合成。携带有 IRES 元件的双顺反子或多 顺反子 rAAV 载体可用于由同一启动子控制的多个基因的共同表达。需要强调的是，IRES 下游基因的有效 表达依赖于特定的 IRES 序列，因此，保证 IRES 基因序列的完整性对于其高效活性至关重要。
IRES 的优点：确保了 IRES 上下游基因的共表达；在 IRES 下游加入亚细胞定位等序列的可行性；
◆自剪切多肽 2A
自剪切多肽 2A 于 1991 年在口蹄疫病毒（FMDV）中被发现，平均长度为 18-22 个氨基酸，位于小 核糖核酸病毒家族成员的两种蛋白质之间。目前，主要有 4 种常用的 2A 肽，分别来源于口蹄疫病毒 2A(F2A)、1 型猪捷申病毒 2A (P2A)、明脉扁刺蛾病毒 2A (T2A)、马甲型鼻炎病毒 2A (E2A)，序列如下：
F2A:VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG
P2A:GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
T2A: EGRGSLLTCGDVEENPG
E2A:QCTNYALLKLAGDVESNPG
2A 肽的优点：结构小，缓解了载体装载量的压力，也为联合应用多种工具构建三个及以上顺反子提供了 可能；上下游蛋白表达均衡；基于 2A 肽的双顺反子载体比基于 IRES 的载体更有效。
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