在蛋白研究的世界里，RIPA裂解液是几乎每个实验室都必备的基础试剂之一。作为一种高效的细胞组织快速裂解液，它在蛋白质提取和后续分析中扮演着不可替代的角色。无论是Western Blot、免疫沉淀还是蛋白质质谱分析，选择合适的裂解液并正确使用是决定实验成败的第一步。

不同配方的RIPA裂解液根据其强度可分为强、中、弱三类。这种分类主要基于去垢剂的类型和浓度，它们直接决定了裂解液破坏细胞膜和核膜的能力。

传统的RIPA裂解液主要由多种去垢剂和抑制剂组成，基本成分包括：

• Tris-HCl（pH 7.4，50 mM）：维持稳定的pH环境
• NaCl（150 mM）：提供适当的离子强度
• 去垢剂：如Triton X-100、NP-40、脱氧胆酸钠和SDS，负责破坏脂质双分子层
• 蛋白酶和磷酸酶抑制剂：防止蛋白降解和去磷酸化

• 非离子去垢剂如Triton X-100和NP-40主要破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质之间的相互作用，溶解细胞膜和核膜。
• 离子型去垢剂如脱氧胆酸钠和SDS则进一步解聚蛋白复合物，并破坏更多的膜结构。
• SDS作为强阴离子去垢剂，能提供强阴离子环境，使蛋白质变性，确保其溶解性。

这种组合使RIPA裂解液能有效处理各种类型的蛋白质——从亲水性的胞浆蛋白到疏水性的膜蛋白。

• 强效型RIPA裂解液含有较高浓度的去垢剂，能有效提取膜蛋白、核蛋白和难溶解的蛋白复合物。
• 中等强度RIPA裂解液在蛋白提取强度和保持蛋白活性间取得平衡，适用于大多数常规蛋白分析实验。
• 温和型RIPA裂解液则能更好地保持蛋白质的天然构象和相互作用，特别适合免疫共沉淀（co-IP）等研究蛋白质相互作用实验。

值得注意的是，如果免疫沉淀时发现目的蛋白无法被沉淀下来，可能是因为裂解液强度过强，此时应换用较为温和的裂解液。

• 预冷样本和器材：实验前需将样本预冷，器材冰浴预冷
• 新鲜配制抑制剂：在使用前数分钟内向RIPA裂解液中加入PMSF（最终浓度1mM）或蛋白酶磷酸酶抑制剂Cocktail
• 裂解液处理：如果裂解液在4°C保存时有SDS沉淀析出，使用前应37°C水浴重新溶解完全后恢复到室温使用

1. 去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2遍
2. 按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液
3. 用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触
4. 冰上放置5-10分钟，期间可震荡3-4次，每次30秒

悬浮细胞处理：

1. 离心收集细胞，轻轻涡旋或弹击管底以分散细胞
2. 按6孔板每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液
3. 冰上放置5-10分钟，期间震荡3-4次

1. 把组织剪切成细小的碎片
2. 按照每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液
3. 用玻璃匀浆器冰上均质30-50次，或超声破碎细胞
4. 镜检确认细胞破碎率不小于90%

1. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清
2. 上清液即可进行后续实验，或用液氮速冻后放-80°C长期保存

• 延长裂解时间
• 添加新鲜蛋白酶抑制剂
• 全程冰浴操作

• 替换为Triton X-100高浓度裂解液
• 使用膜蛋白专用Buffer

• 不检测和基因组DNA紧密结合的蛋白时：直接离心取上清用于后续实验
• 需要检测和基因组紧密结合的蛋白时：通过超声处理打碎透明胶状物，随后离心取上清

需要注意的是，由于RIPA裂解液含有较高浓度的去垢剂，通常不能用Bradford法测定裂解样品的蛋白浓度，而应选择BCA法。

• 细菌和酵母：可以分别使用溶菌酶和破壁酶消化，然后再使用RIPA裂解液进行裂解
• 组织样本：如果组织本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈涡旋使样品裂解充分

选择合适的RIPA裂解液并掌握其正确使用方法，或许就是你下一个突破性发现的起点。