近年来，神经科学领域一直致力于揭示大脑中突触水平的分子机制，但传统成像技术难以在单细胞分辨率下对內源蛋白的不同亚群进行定量可视化。本研究开发了一种创新的光学成像平台，能够在哺乳动物大脑的单个神经元中，对多种內源蛋白的空间和时间亚群——如细胞表面与细胞内、预先存在与新生蛋白——进行高分辨率映射。该平台通过整合CRISPR-Cas9介导的基因组编辑、化学标签标记技术和半自动图像分析流程，实现了在活体或固定脑组织中数千个突触处蛋白动态的全细胞量化。这一突破性技术不仅提供了突触多样性的空间表征，还为理解神经元功能和脑疾病机制提供了新视角。

本论文由Motokazu Uchigashima、Risa Iguchi、Kazuma Fujii、Kaito Shiku、Pratik Kumar、Xinyi Liu、Mari Isogai、Chiaki Hoshino、Manabu Abe、Motohiro Nozumi、Yosuke Okamara、Michihiro Igarashi、Kenji Sakimura、Ryoma Bise、Luke D. Lavis和Takayasu Mikuni共同完成，题为“Single-cell synaptome mapping of endogenous protein subpopulations in mammalian brain”，于2025年11月《Nature Communications》期刊上线发表。

重要发现
01核心贡献：开发单细胞蛋白标记与成像平台
本研究的核心是建立了一个简单且通用的平台，用于在哺乳动物大脑中实现內源蛋白亚群的单细胞水平成像。传统方法如抗体标记或荧光蛋白融合存在穿透性差、信噪比低等问题，难以在厚脑组织中定量分析蛋白分布。该平台通过改进的SLENDR（单细胞水平内源蛋白标记）技术，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）介导的同源定向修复，将化学标签（如HaloTag或SNAP-tag）精准插入特定內源基因位点。化学标签的小分子荧光配体（如Janelia Fluor染料）具有高亮度、光稳定性和组织穿透性，使得在固定或活体脑组织中实现高对比度成像成为可能。

研究人员成功在小鼠大脑皮层锥体细胞中标记了多种內源蛋白，包括突触后支架蛋白PSD95、谷氨酸受体亚基GluA2和GluN1，以及信号蛋白CaMKIIα。通过共聚焦显微镜成像，HaloTag融合蛋白在树突棘处呈现点状累积，与兴奋性突触标记物共定位，验证了技术的特异性。此外，该平台兼容结构照明显微镜（SIM），能够解析纳米尺度的蛋白簇，如GluA2受体在突触的聚集模式。

02实验过程：多模式光学成像与定量分析
在实验设计中，团队首先优化了蛋白标记效率。通过胚胎期子宫内电穿孔将RNP和同源模板导入神经元前体细胞，在出生后3-4周的小鼠大脑中，HaloTag标记效率显著高于传统质粒方法。针对厚组织成像挑战，研究人员采用化学清除技术（如SeeDB2G）处理300微米脑切片，并结合长工作距离物镜进行体积成像。小分子荧光配体均匀穿透组织，而抗体标记仅限于切片表面，凸显了化学标签的优势。

对于定量分析，开发了基于深度学习的半自动管道，能够从单个神经元的全脑图像堆栈中检测数千个突触区域兴趣点（ROI）。以AMPAR受体亚基GluA2为例，通过HaloTag标记和JF646配体染色，在层2/3体感皮层锥体细胞中识别了3016个突触ROI。信号强度热图显示，GluA2 puncta的密度在距胞体25-75微米处最高，而平均强度和变异系数无显著空间差异。这种全细胞突触组映射揭示了蛋白分布的神经元内异质性。

在空间亚群成像方面，团队利用细胞膜不通透性配体（如FLAG2-JF646-HTL）和通透性配体（如JF549-HTL）顺序标记表面和细胞内蛋白亚群。以GluA2和GluN1为例，表面种群信号富集在树突棘头部，且强度与棘头体积正相关。这种双标记技术还能评估突触可塑性，如在SynGAP1敲除神经元中，发现细胞内GluA2池全局减少，表明突触塑性广泛受损。

时间动态成像通过脉冲追踪标记实现。在活体小鼠中，用不同颜色配体分别标记预先存在和新生蛋白亚群。例如，对CaMKIIα进行2小时或72小时间隔标记，显示新生信号随时间增强。结合双光子显微镜活体成像，量化了单个树突棘处蛋白降解率，验证了技术的时空精度。

创新与亮点
01突破传统成像难题
传统內源蛋白成像依赖抗体或荧光蛋白，但抗体分子量大、组织穿透性差，而荧光蛋白亮度不足，难以在厚脑组织中实现定量分析。本平台通过化学标签与小分子配体结合，解决了这些瓶颈。FLAG2-JF646-HTL等不通透性配体选择性标记表面蛋白，而脉冲追踪方案可视化时间亚群，实现了以往无法达到的时空分辨率。此外，RNP-based CRISPR-Cas9编辑提高了标记效率和特异性，避免了脱靶效应。

在生物医学价值方面，该技术能够映射疾病模型中的突触变化。例如，在SynGAP1敲除小鼠中，单细胞突触组分析显示AMPARs塑性广泛异常，为神经发育障碍提供了分子见解。平台还适用于活体监测学习记忆相关蛋白动态，如新生AMPARs在强化突触的插入，有望推动精准脑疾病研究。

总结与展望
本研究开发了一种革命性的单细胞突触组映射平台，通过CRISPR-Cas9编辑和化学标签成像，实现了哺乳动物大脑中內源蛋白亚群的高分辨率定量可视化。该技术突破了传统成像的局限，首次在单神经元水平揭示了突触多样性的空间组织，为理解神经元功能和脑疾病机制提供了新工具。未来，结合活体动态监测和多重标记，这一平台有望揭示学习记忆过程中的突触可塑性规律，并推动个性化医疗发展。尽管蛋白标记可能影响原生结构，但通过计算预测和功能验证，技术将不断优化，最终为脑科学开辟新前沿。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Uchigashima M, Iguchi R, Fujii K, Shiku K, Kumar P, Liu X, Isogai M, Hoshino C, Abe M, Nozumi M, Okamura Y, Igarashi M, Sakimura K, Bise R, Lavis LD, Mikuni T. Single-cell synaptome mapping of endogenous protein subpopulations in mammalian brain. Nat Commun. 2025 Nov 11;16(1):9705.

DOI:10.1038/s41467-025-65813-w.