动作电位（Action Potential，AP）的分析指标：
1) AP：是指心肌细胞在受到有效刺激后，细胞膜电位发生的一种快速、短暂且可逆的电位变化。
2) 心率 (Heart Rate, HR)：HR=1000/BCL(ms) × 60，其中BCL为相邻两个AP之间的周期（ms）。
3) 激活时间 (Active Time)：由激活起点至全部细胞完成激活的时间差，通常基于荧光变化速率最大（dF/dt max）时间点进行判定。
4) 传导速度 (Conduction Velocity, CV)：从最先兴奋的像素点到最后兴奋的像素点的平均速度，CV=d/t，其中d为最早与最晚激活像素点间的距离，t为对应时间差（ms）。
5) 传导离散度 (Conduction Dispersion)：表示不同区域传导速度的空间变异性，通常以标准差或变异系数形式量化。
6) 上升时间 (Rise Time)：AP上升（Depolarization）期间，从基线至峰值所需时间。
7) AP 时程（APD）：细胞膜从AP去极化起始到复极化完成、膜电位恢复至静息水平的总时间，常用APD90表示复极至90%所需时间。
8) APD 异质性（离散）：AP时程离散度表明 AP复极时程的均一性。

钙瞬变（Calcium Transient，CaT）信号的分析指标：
1) CaT振幅 (Amplitude)：CaT波形峰值相对于基线的高度，代表胞内游离Ca2+的最大浓度。
2) 钙释放时间 (Time to Ca2+ Release, Ton)：从Ca2+开始释放至达到最大浓度的90%所用时间。
3) CaT时程 (CTD)：CaT从峰值下降至基线的时间，如CTD₉₀指钙浓度恢复至90%的时间。
4) CTD异质性（离散）：钙瞬变时程离散度表明钙瞬变时程的不均一性。

其他关键指标：
1) 电交替(Electrical Alternans)：同一起搏点下，心电信号出现规律性交替；定义阈值：APD差值 >5ms 或Ca2+瞬变交替的振幅变化率＞20%。
2) 钙衰减时间常数（Calcium decay time constant，Tau）：胞内钙浓度从峰值水平衰减到峰值的1/e（约37%）所需的时间。
3) 舒张期间期(Diastolic Interval, DI)：从AP复极结束至下一次激活开始所用的时间。
4) 心室有效不应期（Ventricular Effective Refractory Period，VERP）：心室肌细胞从一次动作电位的去极化起始（0期去极化）到复极化进程中膜电位恢复至约-60mV的时间段内，无论施加强度多大的刺激，均无法触发一次新的可传导动作电位的时期。
5) 窦房结恢复时间（Sinus Node Recovery Time，SNRT）：窦房结恢复时间（SNRT）是通过心房超速起搏抑制窦房结自律性后，停止起搏，从最后一个心房起搏脉冲到第一个自主窦性P波起点的时间间隔，是评估窦房结自律功能的核心电生理指标。

染料介绍：
1) Rhod-2AM(Rhod-2 acctoxymcthylcster)是一种细胞膜透过性钙离子敏感荧光染料，分子质量为 1123.94g/mol 标准配制溶剂为 DMSO，配制和保存过程需要全程避光。
2)RH-237(4-[2-[6-(Dioctylamino)-2-naphthyl]ethenyl]-1-(3-sulfopropyl)pyridinium hydroxideinner salt)是一种膜电位敏感荧光染料，常与钙敏感染料(如Rhod-2AM)联用。其分子质量为 496.7g/mol，推荐溶剂为DMSO，避光条件下轻柔涡旋混匀，必要时进行短时间超声助溶。

Protocol（小鼠光标测实验案例）

一、实验前准备
（一）主要试剂：
KH液、RH-237、Rhod-2AM、Pluronic F-127、Blebbistatin、肝素钠溶液。

（二）主要器材：
手术剪1把 、眼科剪1把、眼科弯镊2把、止血钳1把、手术缝线（5-0）、100mL量筒1个、2 mL注射器1个、20mL注射器1个、主动脉插管1个、主动脉夹、10cm玻璃培养皿1个、3.5cm培养皿1个、显微镜。

（三）主要溶液配方：
1.KH液

注：KCl、KH2PO4、MgCl2 6H2O可配制为10×母液；溶液配好后需经0.22 μm微孔滤膜过滤；
KH液配制完成后，在使用前，提前30min充氧（混合氧：95%O2, 5%CO2）饱和。

2.肝素钠溶液：生理盐水配制，1000U/mL。
3.兴奋-收缩解偶联剂Blebbistatin母液，DMSO溶解1mg/ml，分装为100µL/tube， -20℃储存备用。（摩尔质量292g/mol）
4.制备荧光染料的母液：为避免反复冻融，将染料提前配制并进行分装储存于-20℃。
A: 电压敏感染料RH237，DMSO溶解为1mg/mL，分装为40µL/tube；
B：钙指示剂Rhod-2AM，DMSO溶解为1 mg/mL，分装为40µL/tube。

二、模型的制备
（一）心脏获取与处理
1.C57小鼠称重，腹腔注射肝素钠（100U/20g），15min后脱颈处死。
2.然后置于实验台固定，倒“T”形开胸，暴露心脏。用镊子夹起肺，使心脏提起，沿肺后部快速剪下心脏, 取心脏置于装有预冷KH液的玻璃培养皿内。

（二）Langendorff灌流
1.在体式镜下迅速找到主动脉，剪去多余组织，将主动脉小心套在套管底部，用手术缝线（规格6-0）结扎扎紧，并将注射器内预先准备的KH液轻轻推入心脏，泵出心脏残血，进行Langendorff灌流。灌流速度为2.5mL / min，灌流温度为37±0.5℃。灌流15min，排出心脏内残余血液及使心脏恢复正常节律。

三、高分辨荧光标测记录（全过程均在避光环境下进行）
（一）停跳及荧光染色
1.心脏稳定后，在50mL循环KH液中加Blebbistatin（150μL），使心脏停跳；
2.加入Pluronic F-127（20μL）脱酯化，辅助钙负载，循环灌流15min；
3.将钙指示剂20μL Rhod-2AM稀释从给药口缓慢注射+20μL Rhod-2AM直接加入循环罐；
4.将电压敏感染料RH237（40μL）加入循环罐后，循环灌注35min；
5.将负载完染料的心脏移至成像灌流室。

（二）数据采集
1.将心电图（ECG）电极放置心脏两侧，连续记录ECG。
2.激发光由两个530±25 nm的LED光源发出，并在511–551nm处进行了带通滤波（LEDC-2001，MappingLab）。
3.通过物镜收集来自心脏的发射光，并用二向分色镜在630nm处分离信号。其中AP信号在700nm处进行长通滤波，而细胞内Ca2+信号用590nm带通滤光片（带宽35nm）进行滤波。使用两个CMOS摄像头（OMS-PCIE-2002，MappingLab）0.8kHz的采样率采集心脏发出的荧光信号。

四、结果展示
（一）小鼠实验结果展示
1.给予左房8Hz刺激后，记录左右心房的动作电位与钙瞬变信号，数据展示如下：

A 图为心脏标测区域示意图
B 图为心房传导等时图
C 图为心房动作电位时程分布图
D 图为左右心房动作电位波形代表图

A 图心房钙信号传导等时图、钙瞬变时程分布图
B 图为左心房钙信号波形代表图

2.窦性节律下心室数据展示：

A 图为小鼠心室标测区域
B 图为心室传导时间等时图
C 图为左右心室动作电位波形图

3.房颤模型数据展示：

A 整个心房致心律失常动作电位交替
B 50Hz起搏刺激下CaT交替的代表图
C-D 50Hz房颤诱发过程中折返现象

五、注意事项
1、用去离子水冲洗系统（冷-热-冷），使系统保持洁净，并通过调节蠕动泵，使出液口达到相应的灌流速度；
2、KH液使用前需要提前充氧（ 95%O2 +5%CO2 ）饱和，使灌流液达到氧饱和状态；
3、排出灌流系统内空气，使灌流液充满整个管路；
4、打开循环水加热系统，调节循环水温度，使流出的灌流液温度为 37℃左右；
5、在光标测实验过程中，通过灌流系统注射停跳剂和荧光染料时注意避光；
6、通过灌流系统注射停跳剂和荧光染料时，需缓慢匀速注射，防止堵塞冠脉造成心肌梗死。

参考文献：
[1]Huaxin S ,Jie S ,Kai L , et al.Increased β1-Adrenergic Receptor Antibody Confers a Vulnerable Substrate for Atrial Fibrillation via Mediating Ca2+ Mishandling and Atrial Fibrosis.[J].Clinical science (London, England : 1979),2023,137(2):DOI:10.1042/CS20220654