冷冻电子显微镜（Cryo-electron microscopy，简称Cryo-EM）是指对冷冻样品进行电子显微镜观察的技术。其目的是尽可能观察样品接近天然状态下的结构。该技术特别适用于含水样品，因此已成为研究生物样本的重要工具。

一、发展背景与挑战

冷冻电子显微镜的诞生经历半世纪之久。20世纪30年代，在Ernst Ruska研制出第一台电子显微镜后不久，Ladislaus Marton意识到，使用这种仪器研究生物样品时，“有机细胞会因强烈的电子轰击而遭到破坏”。他提出，需要开发新的样品制备技术，例如对样品进行冷却。20世纪50年代，Humberto Fernández-Morán首次进行了低温电子显微镜实验，但样品在冷冻过程中因形成冰晶而受到损伤。20世纪70年代中期，Taylor和Glaeser发现，冷却样品可提高其对辐射损伤的耐受性。然而，直到20世纪80年代，Jacques Dubochet找到了一种不产生冰晶的样品冷冻方法，现代低温电子显微镜才真正诞生。
冷冻电镜技术主要面临三个挑战。

1. 在样品制备、转移至显微镜以及在显微镜中观察过程中，需要保持样品处于低于-140°C的低温状态。
2. 电子束敏感性。即使在冷冻条件下，样品也极易受到电子束辐射的损伤，因此透射电镜（TEM）通常采用低剂量条件成像，扫描电镜（SEM）则采用低电压成像。
3. 在冷冻透射电镜中，信号来源于电子束与样品的直接相互作用，却没有使用重金属染色来增强对比度，由于信噪比（SNR）较差，导致成像质量不高。

二、实验流程


冷冻电镜首先通过超低温冷冻技术固定生物大分子或材料，利用透射电子显微镜（TEM）观测其三维结构。其核心原理可概括为以下三步：
1、低温固定：将含水样品（如蛋白质溶液、细胞组织）快速浸入-196℃的液氮冷却乙烷中，数毫秒内实现“玻璃化冻结”——避免传统冷冻导致的冰晶损伤，，而是转化为无定形的玻璃态冰，完美锁定样品的天然构象。
2、电子成像：在液氦温度（4.3K）或液氮温度（77K）下，电子束穿透样品形成二维投影图像。由于生物分子结构复杂，需从数百至上百万张不同角度的投影图中提取信息。
3、三维重构：利用计算机算法对数千张不同角度的二维图像进行分类、对齐与平均处理，通过迭代重投法、自适应建模等技术，反向推算出样品的三维结构模型。如今，该技术已能实现 1.8Å的近原子分辨率（1Å=0.1 纳米），清晰呈现蛋白质的氨基酸侧链、核酸的碱基配对等细节。

三、冷冻电镜分析技术

近年来，“冷冻电镜”这一术语仅被用于指代冷冻透射电子显微镜的结构生物学研究。然而，冷冻电镜实际上还包括两种被广泛使用的技术——单颗粒分析（SPA）与冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）。
那么需要关注的是，我需要采用单颗粒分析还是冷冻电子断层扫描呢？

单颗粒分析（SPA）技术针对纯化后的生物大分子（如蛋白质、病毒、核酸复合物），利用其在溶液中随机取向的特性，采集数十万甚至数百万张单颗粒二维投影图像，通过计算机算法进行分类、对齐与三维重构，最终获得高分辨率三维结构。该技术无需样品结晶，仅需微量纯化样品即可实现解析，尤其适用于异质性强、难结晶的大分子复合物。 优势：

• 解析生物大分子的分辨率最高可达原子级（~1-3Å）。
• 样品受总辐射值小。
• 对称颗粒的解析分辨率更高，是获取其精细结构的黄金标准。
• 适合分子量大的样品。分子量越大，结果越好。

冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）类比医院电脑断层扫描断层扫描技术，通过旋转样品台（倾斜角度范围-60°至+60°），对冷冻后的细胞、组织或原位样品进行多角度二维成像，获取40-60张不同角度的投影图，再基于“中心截面定理”进行三维重构，形成样品的三维断层图像。结合子断层图像平均法（STA），分辨率最高可达3Å，实现细胞内原位生物大分子的结构观测。该技术通常应用于细胞层面的研究，用于分析细胞器的结构及其相互之间的关系，并可应用于完整的小型样品（如细菌）的观察。对于较大较厚的样品，则需要进行切片减薄处理。该技术的重要性在于，它能够在细胞内天然环境中揭示分子结构的真实形态。
优势：

• 保存原始空间背景，直接展示目标分子在细胞原生环境(原位)中的真实状态、位置和与其他细胞器的空间关系。
• 作为一种"无假设"的观测方法，可以在复杂的细胞环境中发现新的结构或已知分子的未知组装形式。
• 简单直接，对样品的要求较低。

四、Cryo-EM在结构生物学的应用

1.新冠病毒刺突蛋白的动态构象
清华大学李赛团队与浙江大学李兰娟团队合作解析出新冠病毒全病毒三维结构（见图2），对疫苗及抗体研发、疫情防控宣传、科普教育、分子动力学模拟等具有十分重要作用，为疫苗设计提供了关键依据。
2.噬藻体A4的侵染机制
中国科学技术大学周丛照团队解析了侵染模式蓝藻鱼腥藻PCC 7120的肌尾噬藻体A-1（L）尾部机器的完整三维结构，揭示了噬藻体A-1（L）与其特异性宿主蓝藻相互作用的结构基础和分子机制。有助于深入理解噬藻体与宿主蓝藻相互作用的分子机制，为将来开发环境友好型底盘噬藻体奠定理论基础。
3.阿尔茨海默病 tau 蛋白的聚集体结构
英国利兹大学的研究团队扫描了阿尔茨海默病患者的死后脑组织，发现阿尔茨海默病患者大脑中的β-淀粉样蛋白中存在混合的微观丝状结构，称为纤维丝，以及其他结构。为揭示阿尔茨海默病的发展机制提供了方向。并且还能启示科学家用于分析其他神经退行性疾病的根本原因。



深圳达远辰光科技有限公司始终致力于为广大生命科学研究机构提供从蛋白表达纯化到蛋白功能研究和结构解析服务，以满足各种科研及新药开发研究需求，兼具快速交付、卓越品质和跨团队/跨平台的高效协同优势。