在生物医学实验室中，研究人员常常面临一个挑战：如何有效分离完整细胞并保持其活性？传统方法往往会对细胞造成损伤，而胶原酶的出现彻底改变了这一局面。

这种酶能够特异性水解胶原蛋白的三维螺旋结构，而不会损伤其他蛋白质和组织。

01 什么是胶原酶？
胶原酶，其化学名为胶原蛋白水解酶（Collagenase），是一种能在生理PH和温度条件下特异性水解天然胶原蛋白三维螺旋结构的酶。

它的化学本质是蛋白质，因此对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感。

胶原酶按照存在方式可分为两大类：人体内源性胶原酶和药用胶原酶。

• 内源性胶原酶是人体内部本身具有的，存在于牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内。
• 而药用胶原酶则是利用生物制药手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而成的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。

02 胶原酶的不同类型
胶原酶不是一个单一的实体，而是一个包含多种类型的酶家族，每种类型都有其特定的应用场景。
根据搜索结果，主要可分为以下几种类型：

• Ⅰ型胶原酶：主要用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。它适用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动物细胞的分离。
• Ⅱ型胶原酶：适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。
• Ⅳ型胶原酶：包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。
• Ⅴ型胶原酶：同样包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。

此外，还有肝细胞专用胶原酶满足特定细胞类型的分离需求。

03 胶原酶的多样化应用
细胞分离与组织消化
胶原酶在细胞分离和组织消化方面发挥着重要作用。当需要消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，胰蛋白酶解离细胞的效果往往不佳，而胶原酶则能有效解决这一问题。

胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，因此特别适用于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，能使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。

常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。

疾病模型建立
在科学研究中，胶原酶被广泛用于建立各种疾病模型。例如，研究人员可以通过关节腔内注射胶原酶的方法诱导颞下颌关节骨关节病动物模型。

复制方法通常是用体重为15-20kg的无角骟努比羊，在动物麻醉后，在一侧关节上腔按478U/kg体重的剂量注射0.5%-1%胶原酶。

这种模型动物均于注药1个月后出现明显的关节病病理损伤，并随观察时间的延长而加重。

临床治疗应用
胶原酶在临床治疗中也展现出巨大潜力。在脊椎介入治疗中，胶原酶是用于治疗椎间盘源性疼痛的关键药物。

在影像设备引导下，胶原酶可被准确注射到椎间盘组织突出物周围并使其溶解，从而有效解除其对脊神经的压迫，达到解除或缓解疼痛的目的。

研究还探索了胶原酶对减少假体包膜形成及挛缩的作用。中国医学科学院整形外科医院研究中心进行的一项动物实验表明，胶原酶能有效降解包膜组织的胶原纤维，减少包膜的形成，对包膜挛缩有一定的防治意义。

04 胶原酶的使用技巧
配置方法
胶原酶的配置需要注意，因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比较大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。

值得注意的是，钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。

消化过程
将漂洗、修剪干净的组织剪成1-2mm³左右的小块。将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30-50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。

将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。

消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间可能需要4-48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15-45分钟。

消化终点的判断与细胞收集
当组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。

上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长。

收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1-2次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。

05 胶原酶在实验研究中的典型应用
椎间盘研究
天津医科大学2005年的一项研究探讨了不同浓度胶原酶对人工培养的椎间盘组织和细胞的形态学影响。

研究将人变性间盘组织或家兔正常间盘组织在无菌状态下剪切，置于含DMEM高糖培养基、20%胎牛血清及转化生长因子（TGF-β）培养液中培养。

研究人员分别加入200U/ml及400U/ml胶原酶200μl，观察各组24小时、48小时、1周时的形态学变化，通过湿重称量和活细胞计数来探讨胶原酶对椎间盘组织的溶解作用。

角膜病变治疗
国立台湾大学医院2019年进行的一项研究探索了胶原酶A在治疗角膜病变中的应用。

研究人员通过用胶原酶A替换分散酶II/胰蛋白酶-EDTA，修改了分离角膜缘干细胞的过程，从而无需使用饲养细胞。

这种方法被称为胶原酶A辅助培养的口腔粘膜上皮移植（CA-COMET），为治疗双侧全角膜缘细胞缺损提供了一种新方法。

癌症研究
胶原酶也在癌症研究中发挥作用。一项关于Ⅳ型胶原酶在肝癌小鼠移植瘤中表达的研究，通过肝被膜下注射和皮下注射癌细胞悬液的方法分别建立了原位移植和异位移植的肝癌小鼠模型。

通过酶谱法分析不同模型中Ⅳ型胶原酶比活性，研究者初步探讨了原位移植模型导致高转移的原因。

胶原酶在科学研究和临床治疗中展现出广阔前景。随着生物技术不断发展，我们对胶原酶的理解也将日益深入。

未来，这种高效的生物工具或许能在组织工程、再生医学及疾病治疗等领域带来更多突破性进展。看似微小，却正在推动医学研究不断向前。

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