多光子显微镜（MPM）生物组织成像技术新进展
2026-01-26 来源:本站 点击次数:82多光子显微镜（MPM）是一种强大的无标记生物组织成像技术，能够通过非线性光学效应获取多种对比度信息。本文介绍了一项创新研究，开发了一种紧凑型多模态成像系统，能够同时实现双光子显微镜（2PM）和三光子显微镜（3PM）的图像采集。该系统采用双激发波长（790 nm和1580 nm），在无需标记的情况下，同步获取双光子激发荧光（2PEF）、二次谐波生成（SHG）和三次谐波生成（THG）信号，从而提供细胞、胶原纤维和界面等结构的互补信息。研究重点解决了双波长同时激发时的信号分离挑战，并提出了基于核的非线性缩放（KNS）去噪算法，以提升低信噪比图像的质量。通过生物样品实验，验证了同时成像在减少运动伪影和热损伤方面的优势，为无标记在体成像奠定了基础。
本研究的核心贡献由WENTAO WU、CHRISTOPH BRANDT、XIN ZHOU和SHUO TANG团队完成，研究成果以题为“Label-free multimodal imaging with simultaneous two-photon and three-photon microscopy and kernel-based nonlinear scaling denoising”的论文形式，发表在光学领域权威期刊《Biomedical Optics Express》上。
重要发现
01系统设计与同时成像原理
研究团队设计了一套基于光纤的紧凑型多模态MPM系统，其核心创新在于通过单一激光源（掺铒光纤激光器）产生双波长激发光。激光经周期性极化镁氧化物掺杂铌酸锂（PPLN）晶体倍频后，输出790 nm和1580 nm的飞秒脉冲，分别用于激发2PM和3PM信号。系统采用微型微机电系统（MEMS）镜进行XY扫描，并结合形状记忆合金驱动器实现轴向深度扫描，整体结构小巧，潜在支持手持式成像头开发。光学布局中，通过二向色分光镜精确分离2PEF、SHG和THG信号，但由于2PEF和THG光谱部分重叠，检测通道存在串扰，需通过后处理减法算法消除。
同时成像的优势显著体现在速度提升和伪影抑制上。与顺序采集（先2PM后3PM）相比，同步采集将成像时间减半，避免了样本运动或机械漂移导致的空间错位。实验以小鼠股骨为例，顺序采集时SHG和THG图像因5分钟延迟出现约6μm偏移，而同步采集基本消除该问题。此外，系统利用双波长的焦距偏移（约80μm）分散激光能量，热模拟显示双焦点成像比单焦点最高温度降低约50%，减少了组织热损伤风险。
02信号处理与去噪算法创新多模态成像的核心挑战之一是各通道信号强度差异大，尤其是THG信号常比2PEF弱数个量级，导致合并图像时噪声凸显。研究提出了一种基于核的非线性缩放（KNS）去噪方法，其原理是通过比较像素局部核区域与全局平均亮度，动态调整像素强度。具体而言，对图像中每个像素生成n×n核（核尺寸根据组织特征大小设定，如20×20像素），利用经验公式计算缩放比，迭代应用以提升信噪比。与传统方法（如高斯滤波、离群值去除）和自监督深度学习算法Noise2Void（N2V）相比，KNS在超低信号图像中表现优异，信噪比提升可达10dB以上，且计算速度快（单图像迭代约34毫秒），适合实时处理。
KNS的普适性通过多种生物样本验证，例如小鼠耳廓软骨层的THG图像（显示软骨细胞陷窝的蜂窝结构）和红枫叶片的SHG图像（源于叶绿体中淀粉和细胞壁纤维素）。在模拟测试中，以高信噪比图像为基准，添加高斯噪声后，KNS处理的结构相似性指数（SSIM）和峰值信噪比（PSNR）均优于N2V，且避免了深度学习黑箱问题的不确定性
03生物成像应用与多模态验证研究在多种生物组织上演示了同时2PM和3PM成像的价值。以新鲜紫杉树叶为例，2PEF清晰显示表皮细胞壁的亮条纹和亚细胞暗环结构，SHG和THG经KNS去噪后，分别凸显叶绿体和细胞内部界面信息。在健康人类骨小梁组织中，THG和2PEF信号深度解析了骨细胞及其陷窝-小管网络：骨细胞以椭圆形结构呈现，THG对比度源于细胞体与陷窝间的折射率差异界面，2PEF则反映细胞质内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等内源荧光团。成像深度方面，2PEF可达170μm，而THG因三光子效应较弱限于100μm以内，SHG则展示了胶原纤维的规则分布，印证样本健康状态。
多模态图像的合并进一步体现了KNS的去噪贡献。未去噪时，低信噪比THG通道的噪声会掩盖其他通道细节；经KNS处理后，噪声显著抑制，组织特征（如骨细胞小管）清晰可辨，提升了图像可读性和分析精度。
创新与亮点
本研究的首要突破是解决了多模态成像中长期存在的技术难题。传统顺序采集2PM和3PM图像时，时间延迟易引入运动伪影和机械漂移，而同时成像通过双波长同步激发消除了这一瓶颈。系统设计上，利用单一激光源频分双光束，避免了多激光对齐的复杂性，结合微型扫描元件，实现了紧凑便携的架构，为在体临床应用铺平道路。此外，针对低信号通道的噪声问题，KNS算法以简单数学缩放替代复杂机器学习，在超低信噪比条件下仍能保留组织特征，解决了多模态图像合并时的质量失衡问题。
在新技术应用方面，KNS去噪方法的提出是一大亮点。其基于局部核比较的机制，无需训练数据或 ground truth，克服了传统滤波器的细节丢失缺陷，也规避了深度学习对大量数据的依赖。算法的高效性使其有望集成于实时成像系统，满足临床快速诊断需求。同时，焦距偏移的“副作用”被转化为优势，通过分散激光能量降低热损伤，体现了设计巧思。
该技术的实际价值在生物医疗领域尤为突出。无标记成像避免了对样本的化学处理，保持了组织原生状态，特别适用于动态监测活体生物过程。例如，在骨组织研究中，THG对骨细胞陷窝网络的成像能力，可为骨质疏松等疾病机制研究提供新工具；在植物学中，多模态对比度能同步揭示细胞壁和叶绿体结构，助力生理学研究。系统的小型化潜力更暗示了未来内窥镜或手持设备的开发可能，推动多光子显微镜从实验室走向床边诊断。总结与展望
本文报道的紧凑型多模态MPM系统，通过同时2PM和3PM成像与KNS去噪技术，实现了高速、高质、无标记的生物组织可视化。系统克服了双波长激发的信号分离挑
并利用焦距偏移降低热风险，结合创新去噪算法，显著提升了多模态图像的实用性和可靠性。实验证明，该技术在动物和植物样本中均能提供互补的结构信息，为生命科学和医学研究提供了强大工具。
论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Wu W, Brandt C, Zhou X, Tang S. Label-free multimodal imaging with simultaneous two-photon and three-photon microscopy and kernel-based nonlinear scaling denoising. Biomed Opt Express. 2023 Dec 6;15(1):114-130.
DOI:10.1364/BOE.504550.