共聚焦与荧光成像技术用于解析高糖下人视网膜类器官的病变
2026-02-26 来源:本站 点击次数:106本研究由Lada Poleovska、Simona Trmaová、Canan Celiker、Eva Hrubá、Francisco Molina Gambin、Václav Chochola、Veronika Matusková、Eleni Beli以及Tomás Barta共同完成。研究成果以《Unveiling the cellular and molecular mechanisms of diabetic retinopathy with human retinal organoids》为题在线发表于《Cell Death and Disease》期刊。
重要发现
本研究的核心在于利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的视网膜类器官，构建了一个模拟“渐进式高血糖应激”的人类视网膜研究模型。研究团队没有采用远超生理范围的极端高糖浓度，而是设定了一个在类器官培养中常用的高葡萄糖基线（17.5 mM），在此基础上仅增加7.5 mM的D-葡萄糖，使终浓度达到25 mM，以此模拟临床上血糖控制不佳导致的血糖水平进一步攀升。通过对比不同分化阶段（第30天、第90天、第150天）的类器官在经历28天高糖处理后的变化，研究揭示了视网膜发育对高血糖响应的阶段特异性与细胞类型特异性。
研究首先证实，在视网膜类器官分化的早期（D30+28）和中期（D90+28）阶段，这种程度的血糖升高并未引起显著的形态学改变。无论是类器官整体的神经上皮样结构，还是其内部的关键视网膜与神经元标记物（如RAX、VSX2、PAX6、SOX2、CRX、NRL）的基因表达与蛋白定位，在高糖组与对照组之间均未发现明显差异。同时，与细胞凋亡相关的基因（BAX, BIM, PUMA）表达也保持稳定。这表明，处于早期发育和命运决定阶段的视网膜前体细胞和未成熟神经元，对高血糖环境具有相当的代谢韧性，其基本发育程序不受干扰。
02晚期类器官光感受器脆弱
当研究聚焦于分化晚期（D150+28）、光感受器趋于成熟的类器官时，景象截然不同。尽管宏观形态依然保持，但分子和细胞层面出现了显著紊乱。基因表达层面，实时定量PCR和转录组测序（RNA-Seq）均一致显示，光感受器外节的关键功能基因，包括视锥细胞色素（OPN1SW, OPN1MW, OPN1LW）和视紫红质（RHODOPSIN），以及视锥细胞抑制蛋白（ARR3）和视杆细胞抑制蛋白（SAG）等，均出现显著下调。结构层面，免疫荧光染色直观地揭示了高糖处理组类器官中光感受器外节结构的缩短和相应标记物信号的减弱。功能层面，使用CellROX™ Green试剂进行的氧化应激检测显示，高糖处理引发了类器官组织内，尤其是外核层和内核层区域，活性氧物种（ROS）的显著增加。
03氧化应激与胶质细胞活化
转录组分析进一步勾勒出高糖应激下的全局分子图景。基因本体（GO）富集分析显示，受影响的通路高度集中于“G蛋白偶联受体信号通路”、“对光刺激的反应”和“视觉感知”等与光感受器功能密切相关的领域。值得注意的是，与氧化应激相关的基因DUOX1和DUOX2表达上调，而超氧化物歧化酶SOD2虽在转录水平未显著变化，但其蛋白水平却明显升高，提示可能存在转录后调控机制。此外，研究还观察到了星形胶质细胞的活化。转录组数据显示星形胶质细胞标记物（CD44, KCNJ10, TGFBR2）上调，免疫染色也证实了胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100β的表达增加及其过程的延伸，这是反应性胶质增生的典型形态特征，表明神经胶质细胞也参与了应对高血糖应激的适应性反应。
04技术核心：高精度成像与多组学分析
为了获得上述发现，研究综合运用了多项前沿的生物成像与分析技术。高分辨率三维成像：研究采用激光扫描共聚焦显微镜对类器官冷冻切片进行成像。通过免疫荧光多重标记，研究人员能够同时在亚细胞分辨率下观察不同视网膜细胞类型（如光感受器、双极细胞、神经节细胞）的形态、分布以及特定蛋白（如光感受器视蛋白、胶质细胞标记物）的表达与定位。这种技术使得可视化高糖导致的“外节缩短”等细微结构病变成为可能。活细胞功能成像：利用CellROX™ Green这种荧光探针，研究人员能够直接、原位地检测和量化类器官组织中由高糖诱导产生的活性氧，将氧化应激这一生化过程转化为可观察、可定量的荧光信号，并精确定位到特定的视网膜细胞层。多组学整合分析：超越单一的形态或基因观察，研究通过转录组测序（NGS）进行了全基因组范围的表达谱分析。这不仅验证并扩展了靶向PCR的结果，发现了更多受影响的基因，还通过生物信息学分析（如PCA主成分分析、GO富集分析）系统性地揭示了受扰动的主要生物学通路。此外，研究还将自身数据与公开的糖尿病患者视网膜转录组数据集进行比对，找到了在光感受器功能障碍、胶质发生和氧化应激反应等通路上的一致性，从而在人类组织层面验证了类器官模型的病理相关性。
创新与亮点
本研究在方法学和应用价值上均体现了显著创新，尤其在如何利用先进成像与分析技术解析复杂生物过程方面。
首先，该研究成功构建并验证了一个更贴近临床病理生理的“渐进式高血糖应激”模型。本研究将葡萄糖浓度从17.5 mM适度提升至25 mM，巧妙地模拟了糖尿病患者血糖控制不佳或妊娠期糖尿病等真实世界中常见的血糖波动场景。这一模型设计上的突破，使得研究者能够捕捉到在相对温和却持续的高糖压力下，晚期光感受器所表现出的选择性脆弱。
其次，研究深度整合了多维度的成像与组学技术，实现了从宏观结构到微观分子机制的贯穿式解析。它并非单一依赖某一种技术，而是将高分辨率共聚焦三维成像（用于观察细胞层结构和蛋白空间分布）、功能荧光成像（用于检测氧化应激等动态生理过程）与高通量转录组学分析相结合。
最后，该研究彰显了人视网膜类器官结合先进成像技术在光学生物医疗领域的巨大应用价值。视网膜类器官能够高度模拟人视网膜的发育、细胞类型多样性和分层结构。当与上述成像技术结合时，该平台便成为一个强大的“人类视网膜模拟器”，可用于：1） 疾病机理的动态可视化研究：实时或终点观测药物、基因扰动、环境压力（如高糖）如何影响特定视网膜细胞（如脆弱的光感受器）的生存、形态和功能。2） 高通量药物筛选与安全性评估：在进入临床前，于高度仿生的人类组织模型上测试神经保护剂、抗氧化剂等潜在疗法对减缓光感受器退化、抑制胶质增生的效果，并能直观评估其细胞毒性。3） 个性化医疗的探索：利用来自特定患者的iPSC构建类器官，结合成像分析，有望在体外预测该个体视网膜对高血糖的易感性，或测试其对不同治疗方案的响应，为实现精准眼科医疗提供新工具。
总结与展望
利用人视网膜类器官模型揭示，渐进式的高血糖应激会特异性损害晚期分化阶段的光感受器，引发其基因表达紊乱、结构损伤、氧化应激和凋亡增加，同时激活星形胶质细胞。这一发现强调了在糖尿病视网膜病变中，神经退行性改变的重要性，且其具有明显的细胞类型和发育阶段特异性。研究所采用的多模态成像与组学整合策略，为在人类特异性模型中精细剖析疾病机制树立了典范。
声明：本文仅用作学术目的。
Polešovská L, Trmačová S, Celiker C, Hrubá E, Gambin FM, Chochola V, Matušková V, Beli E, Bárta T. Unveiling the cellular and molecular mechanisms of diabetic retinopathy with human retinal organoids. Cell Death Dis. 2025 Dec 19;16(1):892.
DOI:10.1038/s41419-025-08244-1.