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细胞不贴壁？原因可能在这！

首先，要给大家介绍一下细胞外基质！

细胞外基质 (ECM) 是组织中由细胞分泌的非细胞部分，是一个错综复杂的蛋白质 3D 网状结构，为细胞提供物理支撑并参与信号传递。

然而,一些细胞在体外培养时不容易分泌 ECM，因此很难粘附在培养载体表面，培养就很困难。

——通常会添加 ECM 来帮助细胞有效贴附到培养皿或其他载体上，模拟细胞与 ECM 之间的相互作用，这些 ECM 就被称为附着因子。

知识链接

【附着因子】

- 通常指用于促进细胞粘附至培养表面或组织支架的蛋白质或分子。
- 这类因子可模拟天然细胞外基质 (ECM) 环境，为细胞提供锚定基础，进而有效促进细胞的粘附、伸展、增殖与分化过程，对改善细胞生长状态与行为具有显著作用。
- 用途：干细胞培养、组织工程支架包被、以及需要优良细胞附着条件的研究，其中附着因子在细胞培养中应用最为广泛。

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常用附着因子？看看这几种！

附着因子包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白等，它们通过与细胞表面的受体结合，构建起可提供结构支持并促进细胞通信的微环境，从而维持细胞的正常稳态与调控^[2]。

1. 纤连蛋白

纤连蛋白 (Fibronectin, FN) 是位于细胞表面和血浆的大分子蛋白质，它能与细胞外基质成分 (如糖胺多糖、蛋白多糖和胶原蛋白) 及细胞表面受体结合，在胚胎发育、伤口愈合等生理过程中起重要作用。

2. 层粘连蛋白

层粘连蛋白 (Laminin) 主要存在于基膜的透明层，紧贴细胞基底表面，在神经生物学领域应用广泛。  

功能方面，层粘连蛋白不仅参与调控细胞粘附、伸展、迁移和增殖等基本生物学过程，还能促进细胞分化与功能修饰，并显著刺激神经突触生长^[3][4]。

3. 胶原蛋白

胶原蛋白 (Collagen) 是重要生物高分子，是动物结缔组织主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白质。

目前已发现 20 多种不同类型胶原蛋白，它们功能各异：纤维状胶原蛋白 (如 I、II、III、V 和 XI 型) 主要在结缔组织中；原纤维相关胶原蛋白 (如 IX 和 XII 型) 负责连接原纤维并介导其与细胞外基质相互作用；网络形成型胶原蛋白 (如 IV 和 VII 型) 是基底层主要部分^[5][6]。

在细胞培养领域，因其优异生物相容性，胶原蛋白被广泛用于内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞等多种细胞的体外培养体系。 

4. 明胶

明胶 (Gelatin) 是一种由胶原蛋白部分水解得到的大分子蛋白质，主要成分为甘氨酸、脯氨酸与羟脯氨酸^[7]。

它常被用作培养板或培养皿的包被材料，可显著提升胚胎干细胞、睾丸细胞等难贴壁细胞的附着效果，并为神经上皮样结构等复杂细胞模型提供理想的生长环境。

5. 玻连蛋白

玻连蛋白 (Vitronectin, VN) 是由 478 个氨基酸构成的糖蛋白，主要存在于血液和细胞外基质中。

玻连蛋白能与糖胺多糖及蛋白多糖相互作用，充当细胞黏附分子。同时作为细胞溶解补体途径的抑制剂，在凝血过程中发挥重要生理调节作用^[8]。

表1. 不同附着因子适配的细胞类型。

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附着因子？有点好用！

当然，如果您实在实在不确定咋选！先来瞅瞅咱家MCE的？！

有科研小伙伴在 FN-HAMA 的合成过程中，添加了购自 Med Chem Express 浓度为 50 μg/ml 的纤连蛋白 (HY-P70593)，效果嘎嘎好！

检测 FN - HAMA 水凝胶对细胞黏附行为的调控作用，结果显示：与未添加 FN 的 HAMA 水凝胶、FN 物理掺入的 FN/HAMA 水凝胶相比，FN - HAMA 水凝胶可显著促进细胞黏附 (图 2)，这与预期一致，原因在于 FN 对细胞黏附有优异支持作用^[9]。 

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当然！纤连蛋白作为主要的细胞外基质蛋白之一，已被研究证实可显著影响干细胞的特性 (如形态、黏附、分化)^[9]。

Patcharapa Tragoonlugkana 等的研究证实，采用纤连蛋白或玻连蛋白涂层的容器培养脂肪来源干细胞 (ADSCs)，可显著优化培养效果^[10]。

相较于常规培养 (对照组)，FN/VN 涂层能显著增强 ADSCs 的粘附与增殖能力： ADSCs 接种 12 小时后，FN 涂层组与 VN 涂层组的细胞粘附率均显著高于对照组 (图 3A)，凸显了附着因子对细胞贴壁的强力促进作用；通过群体倍增时间 (PDT) 评估细胞周期活性发现，在 P5、P7 及 P10 连续传代过程中，FN 与 VN 涂层组的 PDT 值均明显低于对照组 (图 3B)，进一步证实附着因子可通过加速细胞周期进程显著提升增殖效率。

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实验指南？难不住的！

附着因子的核心用法很简单，就是提前给培养器皿做包被预处理，包被的浓度决定了细胞粘附的能力。下面整理了简单的包被步骤，附避坑 Tips，直接抄作业！

操作流程^[10]

『实验准备』

取一支附着因子储液缓慢解冻，使用无菌 PBS (pH 7.2–7.4) 或无血清培养基将其稀释至最佳工作浓度。

Tips：可通过预实验确定适用于目的细胞的包被组分及浓度。Ⅰ 型胶原蛋白的常用稀释浓度为 5–20 μg/mL，纤连蛋白的常用稀释浓度为 1–5 μg/mL。

『加液包被』

根据器皿规格加入足量包被液，确保其完全覆盖器皿底部。轻轻晃动器皿，使液体均匀分布且无气泡残留。

Tips：不同规格培养器皿的包被液添加量如下：96 孔板每孔 50-100 μL，6 孔板每孔 800 μL，T25 培养瓶 2.5 mL。

『孵育』

常规采用 4℃ 过夜孵育，吸附效果最均匀，适用于干细胞、原代细胞；若需快速实验，可选择 37℃ 培养箱孵育 1–2 小时。

Tips：多聚赖氨酸可在室温下孵育 30 分钟以上；层粘连蛋白需避免干燥，4℃ 过夜孵育效果更佳。

『洗涤』

吸除包被液，用无菌 PBS 缓冲液轻柔洗涤 3 次，以去除未结合的残留蛋白。

『封闭』

加入 1% BSA，于 37℃ 孵育 1 小时进行封闭处理，随后用 PBS 洗涤 3 次，以阻断非特异性结合位点。

『接种细胞』

培养状态良好的细胞经胰酶消化后，用无血清培养基重悬，按适宜接种密度接种至已完成包被的孔板中。

Tips：初次实验需设置阳性对照、阴性对照及空白对照组：阳性对照使用未包被的培养器皿，或采用已知的高粘附细胞系/包被条件；空白对照为仅添加培养基而不接种细胞的组别，用于评估背景干扰。

『细胞培养』

37℃ 孵育至预设时间点 (如 20 分钟/40 分钟/1 小时)，随后用 PBS 轻柔润洗 3 次，以去除未粘附的细胞。

Tips：细胞粘附的最佳孵育时间可能因细胞类型及其他实验参数而异，可通过预实验确定；对于粘附能力较强的细胞，需适当缩短孵育时间。

结果检测

体外测定粘附细胞数量时，比色法与荧光法是两大主流技术选择，二者原理各异，且各有其适配的应用场景。

『比色法』

『原理』：结晶紫阳离子可与细胞 DNA 的磷酸基团发生静电结合，使细胞呈现紫色^[10]。

『操作』：采用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟→0.1% 结晶紫染色→Triton/SDS 裂解→通过酶标仪分别读取 550 nm (对应 SDS 处理组) 或 595 nm (对应 Triton 处理组) 处的吸光度值，吸光度越高，说明粘附的细胞数量越多。

『特点』：该方法成本较低、重复性良好，适用于批量样本的检测。

『荧光法』

『原理』：活细胞内的酯酶可将无荧光的钙黄绿素-AM 水解为发强绿光的钙黄绿素 (激发光波长 494 nm，发射光波长 517 nm)^[11]。

『操作』：洗去未粘附细胞→每孔加入 200 μL PBS →使用荧光显微镜或酶标仪检测荧光→计算“贴壁细胞荧光值/总细胞荧光值”的比值，以此确认粘附细胞的数量。

Tip：适用于活细胞的精准检测。

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参考文献：
[1] Surat P. Structure and Function of Proteoglycans. News-Medical (Life Sciences). 2019.
[2] Mogha P, et al. Extracellular matrix protein gelatin provides higher expansion, reduces size heterogeneity, and maintains cell stiffness in a long-term culture of mesenchymal stem cells. Tissue Cell. 2023;80:101969.
[3] Holmberg J, et al. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adh Migr. 2013;7(1):111-121. 
[4] Singh B, et al. Human pathogens utilize host extracellular matrix proteins laminin and collagen for adhesion and invasion of the host. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(6):1122-1180. 
[5] Shahrajabian MH, et al. Mechanism of Action of Collagen and Epidermal Growth Factor: A Review on Theory and Research Methods. Mini Rev Med Chem. 2024;24(4):453-477. 
[6] Holmes DF, et al. Collagen Fibril Assembly and Function. Curr Top Dev Biol. 2018;130:107-142.
[7] Ahmad MI, et al. Collagen and gelatin: Structure, properties, and applications in food industry. Int J Biol Macromol. 2024;254(Pt 3):128037.
[8] Pellegrini A, et al. Recruitment of Vitronectin by Bacterial Pathogens: A Comprehensive Overview. Microorganisms. 2024;12(7):1385. Published 2024 Jul 8.
[9] Wu X, et al. Stem cell niche-inspired microcarriers with ADSCs encapsulation for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2023 Mar 3;26:159-168. 
[10] Lazarovici P, et al. Cell-Based Adhesion Assays for Isolation of Snake Venom's Integrin Antagonists. Methods Mol Biol. 2020;2068:205-223. 
[11] Liu P, et al. Inflammatory Smooth Muscle Cells Induce Endothelial Cell Alterations to Influence Cerebral Aneurysm Progression via Regulation of Integrin and VEGF Expression. Cell Transplant. 2019;28(6):713-722.