噬菌体筛选助力长效C5a阻断肽遏制炎症级联反应抑制脓毒症器官衰竭
2026-01-30 来源:本站 点击次数:50摘要：
脓毒症是由感染引发宿主免疫反应失调，进而导致严重器官功能障碍、病死率极高的危重症，探寻安全有效的干预手段迫在眉睫。鉴于现有脓毒症相关药物临床试验多以失败告终，本研究通过噬菌体筛选技术，研发并验证了一种新型长效 C5a 阻断环状肽 Cp1，其通过靶向中和炎症上游关键分子 C5a，阻断其介导的炎症级联放大反应。感染早期应用 Cp1，可高效抑制炎症因子瀑布效应，遏制失控性全身炎症的发生发展，为脓毒症的防治提供新方向。
体外及体内研究验证，Cp1 对 C5a 具有高亲和力与高阻断选择性，且血浆稳定性优异，可实现长效全身循环。在盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型中，Cp1 显著降低血浆与腹腔灌洗液（PLF）内炎症因子、趋化因子的表达，改善先天免疫损伤；单次给药即可显著降低模型小鼠的细菌负荷，缓解器官功能障碍，延长其生存时间。综上，新型环状肽药物 Cp1 在脓毒症的预防与治疗中展现出显著优势，兼具良好的应用前景与成本竞争力。
实验结果 1 分子对接与结合模式分析解析 mC5a 与 Cp1 的相互作用机制。
为阐明 Cp1 相较其线性对照肽 K1 具备更高结合亲和力与特异性的结构基础，本研究采用分子对接及结合模式分析，系统解析了 mC5a 蛋白与 Cp1 的分子相互作用模式。分子对接结果以多维度图示呈现，包括 mC5a-Cp1 复合物的卡通示意图（图 1c）、二维相互作用图（图 1d）、蛋白表面结合图（图 1f）及三维精细结构模型（图 1g）。其中，mC5a 蛋白主链骨架以黄色标识，氮原子、氧原子与氢原子分别以蓝色、亮红色及白色渲染，Cp1 则以紫色棒状模型展示；氢键与盐桥相互作用分别以洋红色虚线与蓝色虚线标示。此外，小鼠 C5a 与人源 C5a 的序列比对结果，明确了潜在介导 Cp1 结合选择性的关键氨基酸残基（图 1e）。
结构分析显示，Cp1 与 mC5a 之间形成 6 个氢键与 2 个盐桥。具体而言，Cp1 的多个羰基作为氢键受体，与 mC5a 的 ARG708 残基形成两条氢键，键长分别为 2.0Å 与 2.4Å；Cp1 咪唑环上的氮原子作为氢键供体，与 mC5a 的 GLU688 残基形成键长为 1.9Å 的氢键；Cp1 的羧基氧作为氢键受体，与 mC5a 的 ARG684 残基形成 1.6Å 的氢键；Cp1 的多个氨基作为氢键供体，与 GLU688 残基形成两条键长均为 1.6Å 的氢键。同时，Cp1 还分别与 mC5a 的 ARG684 及 GLU688 残基形成两条盐桥。与之相比，K1 与 mC5a 的结合位点存在显著差异，其形成的氢键相互作用强度显著偏弱，键长分别为 2.6Å、3.1Å、2.9Å、3.0Å、2.9Å 与 2.9Å。
研究进一步解析了 mC5a 与 C5aR1 的结合模式（图 1h、i），三维结构模型显示二者共形成 7 条氢键。值得注意的是，Cp1 与 mC5a 的 ARG708 所形成的两条高亲和力氢键（2.0Å、2.4Å），可竞争性干扰 mC5a 的 ARG708 与 C5aR1 的 ASP25 之间的相互作用（键长 2.8Å），进而有效阻断 mC5a-C5aR1 的信号传导。综上，Cp1 与 mC5a 的相互作用强度显著优于线性肽 K1，其独特的结合位点可更高效地阻断 mC5a 与受体 C5aR1 的结合，这为 Cp1 结合亲和力的提升提供了核心结构依据。从分子机制层面，环状肽的环化策略可增强肽 - 蛋白相互作用间的静电屏蔽效应，同时 C5a 蛋白的疏水区域可协同降低 Cp1 的溶剂可及性，最终赋予其优异的血浆稳定性。
实验结果 2 新型 C5a 靶向阻断肽的筛选与鉴定
以重组小鼠 C5a 蛋白为包被抗原，借助噬菌体展示肽库技术，从十二肽随机库中开展靶向结合肽的高通量筛选。经三轮亲和富集与筛选后，随机挑选八十个阳性单克隆进行 DNA 测序，最终获得七条特异性候选结合序列。
以重组小鼠 C5a 蛋白为包被抗原，借助噬菌体展示肽库技术，从十二肽随机库中开展靶向结合肽的高通量筛选。经三轮亲和富集与筛选后，随机挑选八十个阳性单克隆进行 DNA 测序，最终获得七条特异性候选结合序列。
采用生物层干涉技术（BLI）进行初步亲和力快速筛查，测得候选线性肽 K1–K5 的平衡解离常数（KD）分别为 5.94×10⁻⁶ M、1.73×10⁻⁵ M、1.10×10⁻⁴ M、8.50×10⁻⁴ M 及 1.09×10⁻² M。在此基础上，通过表面等离子体共振技术（SPR）对亲和力相对优异的线性肽 K1–K4 开展精确验证，其与小鼠 C5a 的 KD 值分别为 2.85×10⁻⁶ M、5.36×10⁻⁵ M、7.12×10⁻⁶ M 和 2.38×10⁻⁶ M（图 2a）。
综合亲和力与成药性评估，K1 与 K3 的水溶性显著优于 K2、K4，更适用于脓毒症小鼠模型的系统性给药研究，因此被选定为后续结构优化的先导序列。
实验结果 3 线性靶向肽的 C5a 阻断活性验证
为评估候选线性肽对 C5a 的功能性阻断效应，采用高表达 C5aR1 的小鼠中性粒细胞，开展竞争性结合实验。流式细胞术检测结果表明，K1 与 K3 对 Cy5 标记 C5a 的竞争性阻断效能显著优于 K2 和 K4（图 2b）。
在 C5a 介导的中性粒细胞趋化实验中，借助 IncuCyte ZOOM® 活细胞成像系统，对体系内总残留细胞面积进行实时动态监测，结果进一步证实，K1 和 K3 的体外阻断活性显著强于 K2 与 K4（图 2c）。
构建小鼠脓毒症模型并进行体内药效评价，给药 24 小时后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中炎症细胞因子及趋化因子水平，结果显示 K1 和 K3 的体内抗炎作用同样优于 K2 和 K4（图 2d）。综合体外阻断效能与体内抗炎活性，选定 K1 与 K3 作为后续结构优化与功能验证的先导肽。
实验结果4 环化策略对线性肽结合亲和力、阻断特异性及血浆稳定性的影响
为提升线性肽K1、K3的结合亲和力、结构稳定性及体内阻断效力，作者对其进行头尾环化修饰，得到环状变体Cp1、Cp3。表面等离子体共振技术检测显示，Cp1、Cp3与mC5a的结合亲和力KD值分别为5.63×10⁻⁶、3.23×10⁻⁶（图2e）；Cp1与人源C5a（KD=7.41×10⁻⁶）的结合动力学特性与mC5a相近，且可结合小鼠C5a-desArg（KD=3.58×10⁻⁶）及小鼠C5（KD=7.12×10⁻⁷）（图2e），体外竞争性结合实验进一步验证了二者对mC5a的阻断效力（图2f）。
溶血实验评估Cp1结合特异性显示，阳性对照依库珠单抗可完全抑制溶血，Cp1组羊红细胞近100%溶血，表明其结合C5a不干扰C5裂解及终末膜复合物（MAC）形成（图2g）；而Cp3组出现部分溶血，提示其结合特异性弱于Cp1（图2g）。流式细胞术结果证实（图2h），Cp1可选择性阻断C5a-C5aR1相互作用，不影响抗C5aR1抗体对Cy5-C5a与中性粒细胞结合的抑制作用。
37℃条件下，采用正常小鼠及CLP模型小鼠50%（v/v）血浆评估Cp1与K1的稳定性，HPLC结果显示，二者在正常血浆中稳定性相当，而环化修饰显著提升K1在CLP血浆中的稳定性，孵育24小时后Cp1保留率超95%（图3a, b）。正常小鼠药代动力学研究显示（100μg/20g Cp1），Cp1在24小时内缓慢消除，给药14天后血浆初始浓度（68 nmol/mL）保留率仍达90%（图3c-f）。
实验结果5 Cp1处理能有效抑制C5a驱动的中性粒细胞招募与活化
通过测定正常小鼠及CLP模型小鼠血浆中C5a/C5比值，评估Cp1对C5a的体内中和效应。结果显示，Cp1处理可降低C5a/C5比值，且该效应在CLP模型小鼠中更为显著，证实Cp1能有效中和体内小鼠C5a（图3g）。
中性粒细胞是脓毒症病理生理级联反应的关键效应细胞，其功能贯穿疾病全程。补体裂解产物C5a通过C5a-C5aR轴调控中性粒细胞的活化、趋化及吞噬功能。采用qPCR和ELISA法，测定100μg/20g剂量Cp1给药后血浆游离DNA（cfDNA）及中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平。图3h、i定量结果显示，Cp1给药可显著降低血浆cfDNA（↓68%）和NE（↓100%）水平，直接证实其可抑制中性粒细胞活化及呼吸爆发，抑制率以假手术组（设为0%）为基准计算。
趋化实验采用IncuCyte ZOOM®活细胞成像系统进行监测与定量分析，图3k、m中y轴“各组初始面积归一化总面积”指同一视野内各时间点细胞总面积与0小时初始面积的比值，比值越高提示细胞迁移活性越低。结果显示，Cp1以剂量依赖性方式抑制C5a驱动的PMNs及小鼠中性粒细胞募集，证实其对C5a具有有效阻断作用（图3k、m）；图3j、l分别为图3k、m的24小时定量结果。
采用流式细胞术，借助红色大肠杆菌生物颗粒™和绿色金黄色葡萄球菌生物颗粒™定量分析PMNs吞噬功能，随后利用活体大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）进一步验证。C5a刺激6小时后，生物颗粒及活菌实验中C5a诱导的荧光信号均显著降低，该效应可通过Cp1预孵育缓解（图3n）。等效C5a剂量下，PMN对金黄色葡萄球菌的吞噬效率下降幅度小于大肠杆菌，推测其原因在于：金黄色葡萄球菌清除依赖C5a非敏感途径，而大肠杆菌清除高度依赖补体-活性氧轴，该轴可被C5a干扰。上述结果共同表明，Cp1能有效缓解C5a诱导的PMN吞噬功能障碍。
实验结果 6 Cp1 处理显著抑制 CLP 诱导脓毒症小鼠血浆及腹腔冲洗液（PLF）中炎症因子与趋化因子的表达
血液学分析显示 CLP 术后不同组别中性粒细胞与单核细胞的动态变化。CLP 组循环中性粒细胞数量术后 4h 较假手术组升高 70%，12h 达峰值，较假手术组升高 265%；Cp1 处理组中性粒细胞无显著激增，12h 绝对计数较 CLP 组下降 63%。CLP 组绝对单核细胞计数 4h 达首峰，较假手术组升高 148%；Cp1 处理组单核细胞峰值延迟至 12h，较假手术组升高 69%，计数较 CLP 组 4h 峰值降低 38%（图 3o）。
通过定量检测血浆及腹腔冲洗液中促炎细胞因子与趋化因子，评估 Cp1 对 C5a 介导炎症级联反应的抑制作用。CLP 术后 24h，100μg/20g Cp1 处理使血浆促炎因子 IL-6、TNF-α、IL-1β 分别下降 99%、86%、94%；单核细胞趋化因子 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7 分别下降 21.7 倍、81.9 倍、24.8 倍、18.6 倍、102.3 倍；中性粒细胞趋化因子 CXCL1、CXCL5 分别下降 61.7 倍、4.3 倍；IL-17A、IFN-γ、GM-CSF、CX3CL1 水平亦显著降低（图 4a）。腹腔冲洗液中，Cp1 处理使 IL-6、TNF-α、IL-1β 分别下降 73%、77%、62%，CXCL1、CXCL5、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL12 分别下降 75%、94%、96%、87%、89%、69%、90%（图 4b），抑制率以假手术组为 0% 基准计算。
Cp1 对血浆细胞因子的抑制作用显著优于等剂量 K1。100μg/20g K1 使血浆 IL-6、TNF-α、IL-1β 分别降低 3.7 倍、1.5 倍、2.0 倍（图 2d）；而同剂量 Cp1 分别降低 220.5 倍、7.5 倍、18.6 倍（图 4a），验证了环化修饰的体内优势。300μg 高剂量 Cp1 亦可显著抑制血浆及肝脏组织中炎症因子与趋化因子表达（图 4）。
剂量滴定结果显示，100μg 为具有显著药理活性的最低有效剂量，后续动物实验均采用该剂量。图 3o 与图 4 结果共同证实，Cp1 通过阻断 C5a 介导的先天免疫细胞募集与过度活化，有效抑制脓毒症小鼠体内炎症因子与趋化因子的表达，缓解早期炎症反应。
实验结果7 Cp1治疗可有效预防CLP诱导的脓毒症小鼠出现器官功能障碍
脓毒症高死亡率主要源于重要器官损伤及急性衰竭。Cp1治疗可有效降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，提示其对肝功能具有保护作用（图5a）。与未治疗CLP小鼠相比，Cp1处理组血清肾损伤标志物尿素（UREA）和肌酐（CREA）水平显著降低（图5b）。血清乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸（LAC）升高提示组织损伤，Cp1处理组二者水平显著下降，进一步证实其强大的器官保护效能（图5c）。
脓毒症中补体-凝血系统相互作用促进疾病进展，常伴随消耗性凝血病，表现为凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）升高，凝血酶时间（TT）延长及纤维蛋白原（Fbg）异常。靶向阻断C5a可同时抑制过度炎症反应及脓毒症相关凝血功能障碍。如图5d所示，Cp1通过靶向阻断C5a，显著减轻脓毒症对凝血及纤溶系统的病理损伤。
此外，Cp1可有效保护脓毒症小鼠肺损伤，显著改善脓毒症诱导的肺血管渗漏，减轻肺泡出血、隔膜增厚及炎症浸润等标志性病理改变（图5e）。与CLP组相比，Cp1处理后循环内皮损伤标志物VCAM-1、E-选择素和PAI-1水平分别下降100%、71%和93%（图5f）。同时，Cp1处理组肺内皮完整性显著改善，表现为肺湿干比（W/D比）下降85%、HAS渗漏量（BALF/血清比）下降83%及伊文思蓝渗漏量（肺液/血清比）下降54%，上述指标共同证实Cp1对内皮细胞的保护作用（图5g–i）。
实验结果8 Cp1治疗能有效控制细菌负荷，并显著延长CLP诱导的脓毒症小鼠的存活时间
为评估Cp1对脓毒症期间全身细菌播散的调控效果，对CLP模型小鼠外周血样本进行定量细菌培养。24小时细菌培养及菌落形成单位（CFU）计数结果显示（图5j, k），与CLP组相比，100μg和300μg剂量Cp1处理分别使脓毒症小鼠细菌负荷降低93%和86%，提示Cp1通过早期靶向阻断C5a介导免疫调节，可恢复机体免疫平衡，并显著增强脓毒症小鼠的细菌清除能力。
采用Kaplan-Meier法，分析单次给予100μg/20g剂量Cp1或K1后脓毒症小鼠的存活情况，以确认动物死亡为判定标准。结果显示（图5l），CLP组、CLP＋K1组及CLP+Cp1组的7天存活率分别为0%、0%和60%；三组中位生存时间分别为30小时、48小时和120小时。CLP+Cp1组存活率及中位生存时间显著提升，证实Cp1的有效干预作用，提示C5a阻断是脓毒症预防与治疗的可行策略。
实验结果9 Cp1治疗可有效清除继发感染
为探究短期药物暴露对继发感染反应的影响，比较CLP术后24小时Cp1组与CLP对照组的LPS反应性（图6a）。结果显示（图6b），LPS刺激2小时后，Cp1组IL-6水平较CLP对照组显著升高，提示脓毒症中期（24小时）的Cp1暴露，可对CLP处理小鼠的LPS反应性发挥有益调节作用。
为评估长期药物暴露对继发感染反应的影响，LPS模型小鼠经Cp1暴露14天后，进行活菌静脉注射（图6c）。菌落计数结果显示（图6d、e），与未处理对照组相比，Cp1长期（14天）暴露后，仍可有效清除新发感染。
实验结果10 Cp1处理可阻断并重塑C5a诱导的外周单核细胞基因表达改变
为探究Cp1靶向阻断C5a-C5aR1对下游信号通路的调控效应，于人外周血单核细胞（PBMCs）经C5a刺激后进行RNA测序分析。差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log2FoldChange|≥1且P<0.05。如图6f所示，各组样本均表现出高度组内一致性。C5a刺激可诱导PBMCs中2552个DEGs上调（图6g）；而经Cp1预处理后，2235个DEGs显著下调（图6g），使Cp1处理组基因表达谱与未处理对照组趋于一致（图6h）。
火山图进一步标注了Cp1预孵育后关键下调DEGs，其功能与炎症调节、促炎细胞因子分泌、免疫细胞招募增强及白细胞存活延长相关（图6i）。GO富集分析显示，DEGs中排名前20的分子功能（MF）术语中，G蛋白偶联趋化因子受体活性下调具有最高统计学显著性，为Cp1对C5a-C5aR1轴的精准阻断提供了强有力的基因水平证据（图6j）。
Reactome通路富集分析泡状图显示，与GPCR配体结合相关的DEGs发生最显著改变，进一步证实Cp1的精准阻断作用（图6k）。KEGG信号通路富集分析表明，这些DEGs与C5a关键下游信号级联显著重叠，包括炎症反应、细胞凋亡及细胞迁移通路（图6l, m）。
此外，亚细胞定位分析显示，差异表达基因主要分布于膜结合区及细胞外区室，提示该基因表达改变可能源于Cp1预孵育介导的细胞外受体相关信号通路重塑（图6n）。综上，生物信息学分析证实，Cp1处理可阻断并重塑PBMCs中C5a诱导的基因表达谱，为本研究体外及体内实验结果提供了具有说服力的转录组水平依据。
实验结果11 Cp1表现出令人满意的生物安全性
乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫组化、DSP空间多组学等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。
原文点击：STTT｜长效 C5a 阻断肽，遏制炎症级联反应，守护脓毒症患者器官功能
通过体外及体内实验，系统评估新型环状肽药物Cp1的生物安全性特征。细胞毒性检测结果显示，梯度浓度Cp1孵育后，细胞活力未发生显著下降。血浆细胞因子谱分析及血液学检测表明，Cp1未诱发免疫毒性及急性骨髓抑制。血液生化分析与组织病理学检查进一步证实，Cp1未引发肝肾功能毒性及组织损伤。综合上述实验数据，证实Cp1具备良好的生物安全性。
脓毒症相关的炎症因子检测哪里有？
LabEx提供脓毒症相关炎症因子、趋化因子检测服务：
| 货号 | 产品名 | 检测指标 |
| LXLBH10-1 | 人炎症10因子Panel | IL-1 β/IL-1F2，IL-2，IL-4，IL-6 ,IL-8/CXCL8，IL-10，IL-12 p70，IL-13，TNF-α，IFN-γ |
| LXLBM31-1 | 小鼠趋化因子-31因子Panel | BCA-1/CXCL13,CTACK/CCL27,ENA-78/CXCL5,Eotaxin/CCL11,Eotaxin-2/CCL24,Fractalkine/CX3CL1,GM-CSF,I-309/CCL1,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-16,IP-10/CXCL10,I-TAC/CXCL11,KC/CXCL1,MCP-1/CCL2,MCP-3/CCL7,MCP-5/CCL12,MDC/CCL22,MIP-1α/CCL3,MIP-1β/CCL4,MIP-3α/CCL20,MIP-3β/CCL19,RANTES/CCL5,SCYB16/CXCL16,SDF-1α/CXCL12,TARC/CCL17,TNF-α |
| LXLBR10-1 | 大鼠炎症10因子Panel | IL-1 β/IL-1F2，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6 ，IL-10,IL-12p70,CXCL1/GRO/α/KC/CINC-1，IFN-γ，TNF-α |
乐备实（上海优宁维生物科技股份有限公司旗下全资子公司），是国内专注于提供高质量蛋白检测以及组学分析服务的实验服务专家，自2018年成立以来，乐备实不断寻求突破，公司的服务技术平台已扩展到单细胞测序、空间多组学、流式检测、超敏电化学发光、Luminex多因子检测、抗体芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫组化、DSP空间多组学等30多个，建立起了一套涵盖基因、蛋白、细胞以及组织水平实验的完整检测体系。
原文点击：STTT｜长效 C5a 阻断肽，遏制炎症级联反应，守护脓毒症患者器官功能
相关文章
更多 >