实验内容与方法（以 hESC H1 及 6 孔板 1 个孔为例）

一、试剂准备
各阶段培养基成分

(1）在 4℃解冻 补充剂 A、B、C、D、E，不要在 37℃条件下解冻。
(2)  在生物安全柜中，参考表 1 及表 3，按照比例使用无菌移液管及枪头混匀配制成分化各阶段培养基 。例如 mNPC 诱导培养基（0-2）组成为基础培养基 1、1×浓度的补充剂 A、B，若用量为 10mL，配制方法为 8.8 mL 基础培养基 1+200μL 补充剂 A（50×）+1 mL 补充剂 B（10×）。
(3) 分化培养基建议现配现用，置于 4℃储存，2 周内使用。

注：补充剂 B 使用时尽量避光，且所有补充剂可根据使用量进行分装以避免反复冻融。

二、hESC 培养和准备（详见Advance 人多能干细胞培养基使用说明书）

三、DAY 0-9: hESC 分化为中脑神经祖细胞（mNPC）
(1) 包被液 1 和 2 在 4℃下解冻，与 DMEM/F12 均匀混合，按 2 U/cm2的包被密度铺板，备用。
(2) DAY 0：当hESC的汇合度达到75%-85%，吸去培养基，用2mL 1x室温PBS（不含Ca 2+ /Mg 2+ )清洗 hESC，吸去 PBS。
(3) 加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室温 Accutase，转移到 37℃ 5% CO2细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(4) 3-5min 后，将干细胞传代培养基以等体积直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到 15mL 离心管中，室温下 300 g 离心 5 min。
(5) 从包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。
(6) 离心结束，充分去除上清，将 1 mL 预热的 mNPC 诱导培养基（0-2）（成分为：基础培养基 1，1×补充剂 A，1×补充剂 B）（含 10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(7) 使用自动细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除死亡细胞，将细胞接种到步骤 1 制备的包被板上使得最终密度为 6.0 -8.0×104个细胞/cm2，在 6 孔板中每孔最终体积为 2 mL（含 10μM Y-27632），将孔板转移到 37℃、5%CO2 细胞培养箱中孵育 48 h（若 24 h 后培养基变黄则及时用含 10μM Y-27632 的 mNPC 诱导培养基换液(0-2)）。
(8) DAY 2：使用 mNPC 诱导培养基（2-7）换液（成分为：基础培养基 1，1×补充剂 A，1×补充剂 C），直到第 7 天。
(9) DAY 7：使用 mNPC 诱导培养基（7-9）换液（成分为：基础培养基 1，1×补充剂 A，1×补充剂 D），培养至第 9 天。可取第 9 天的细胞进行免疫荧光染色检测 NPC 标志物如 SOX2、Nestin，中脑标志物 FOXA2。

注：包被液使用时需在冰上操作，所有与包被液直接接触的物品需提前预冷。包被液铺板后尽量于 1 周内使用,使用前需至于室温 1h 或 37℃培养箱孵育 30 分钟以上，以恢复至室温。

四、DAY 9-23: mNPC 诱导分化为中脑多巴胺神经元(mDA)
(1) DAY 9： 第 9 天，从培养物中抽吸培养基，在 6 孔板中每孔用 2 mL 1×室温 PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培养物，然后从孔中移除 PBS。
(2) 加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室温 Accutase，转移到 37℃ 5% CO2 细胞培养箱中3-5min，使其解离成单细胞。
(3) 3-5min 后，将 DMEM/F12（含 10μM Y-27632）以等体积直接加入 Accutase 中，并使用P-1000 吸头轻轻上下吹打细胞，制成单细胞悬液，将细胞单悬液收集到 15mL 离心管中，室温下 300 g 离心 5 min。
(4) 从包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不损坏涂层表面。
(5) 离心结束，充分去除上清，将适量预热的 mDA 诱导培养基（成分为：基础培养基 1，1 ×补充剂 A）（含 10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。按 1:3 比例接种在包被液 1 包被的板中，每孔加入 2 mL 细胞悬液于 37℃、5%CO2 细胞培养箱培养24h 。
(6) DAY 11: 第 11 天开始根据培养基颜色每天或隔天更换一次 mDA 诱导培养基，直到第 23 天。

注：D23 天的 mDA 可用无血清细胞冻存液plus（abs9478）在液氮中冷冻。

五、DAY 23-40: mDA 成熟阶段
(1) DAY 23: 第 23 天，从培养物中抽吸培养基，在 6 孔板中每孔用 2 mL1×室温 PBS（不含 Ca2+/Mg2+)清洗培养物，吸去 PBS。
(2) 每孔加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室温 Accutase，将培养物置于 37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育 5 min。
(3) 5min 后每孔加入 1mL DMEM/F12（含 10μM Y-27632），轻轻吹打细胞，使其脱离孔底。
(4) 将细胞悬液收集到 15 mL 离心管中，室温下 300 g 离心 5 min。
(5) 仔细抽吸上清液，不干扰细胞，用 1mL 恢复室温的 mDA 成熟培养基（成分为：基础培养基 2，1×补充剂 E）（含 10μM Y-27632）重悬细胞，轻轻地上下移液以确保单细胞溶液均匀。
(6) 使用台盼蓝排除死亡细胞，自动细胞计数器计数细胞，将细胞接种到提前制备的包被液 2 包被的 6 孔板上使得密度为 6-8×10^5个细胞/cm2 ，根据培养基颜色每天或隔天换液，直到第 25 天。
(7) DAY 25: 更换为不含 Y-27632 的 mDA 成熟培养基。根据培养基颜色每天或隔天换液，直到第 40 天。
(8) 第 40 天可检测到神经元标志物（MAP2），多巴胺神经元标志物（TH、DAT、GIRK2）的表达。

注：由于细胞密度较高，注意及时换液。

产品信息表

1、试剂盒组成信息

注：括号内容如50×为母液浓度，使用时终浓度需为1×。例如补充剂A（50×）和补充剂B（10×）需添加进基础培养基1使其分别稀释50倍以及10倍，使得补充剂终浓度为1×，配成mNPC诱导培养基（0-2）。

包被液1浓度250U/mL表示每毫升有250个单位的包被蛋白，在本方案中铺板时，每平方厘米需要2个单位的包被蛋白。

2、辅助试剂

3、辅助耗材

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