流式实验中需要使用的新的流式抗体或者对于抗体使用浓度不太清楚时，就需要进行滴度。流式抗体滴定是流式实验成功、获得可重复且准确数据的基石，其主要原理是通过不断稀释抗体，找到既能有效结合目标抗原，又能避免非特异性染色的最佳浓度。合理的滴度实验可以有效的提升信噪比、节约成本同时优化实验条件，保证不同实验条件（如细胞类型、实验方案、温度等）下最佳抗体使用浓度，获得最佳使用效果。

一、滴定前准备

确定滴定范围：

参考抗体说明书或文献推荐的起始浓度。若无，可从 0.125 µg/test 到 2-4 µg/test 开始（对于直接标记抗体），通常设置4-6个梯度。

准备样本：

• 使用与正式实验相同的样本类型（如：同种属的脾细胞、PBMC、细胞系等）。

• 样本应包含明确的阳性群体和阴性群体（用于计算信噪比）。如果目标抗原表达未知，可用已知阳性和阴性的细胞系或通过刺激/未刺激样本对比。

• 准备足够的细胞，每个浓度点至少需要 5×10^5 - 1×10^6 个细胞（考虑设置复孔和对照）。

必要对照：

• 未染色对照：只加细胞，不加抗体。

• 同型对照：与滴定抗体相同物种、亚型、标记物的非特异性抗体，用于设置电压和评估背景。注意：现代流式更推荐使用荧光减一对照（FMO） 来设门，尤其是在多色实验中。
   

示例：滴定小鼠抗人CD3-FITC抗体，建议测试浓度：0.125， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0 µg/test。

1. 分配细胞：取5支流式管，每管加入1×10^6个细胞（体积一致，如100µL）。

2. 稀释抗体：将抗体母液按计划梯度稀释至工作液浓度，确保每管加入的体积一致（例如10µL），并用缓冲液（如含1% BSA的PBS）补足体积至相同。

3. 孵育：按照标准染色流程（避光、4°C或冰上孵育15-30分钟）。

4. 洗涤与重悬：加入2-3mL染色缓冲液，离心弃上清，用300-500µL缓冲液或固定液重悬细胞，上机检测。

5. 设置仪器：先用未染色对照调节所有通道的电压，使阴性群体落在对数坐标轴的10^0-10^1范围内。此后，所有样本的电压保持不变！

三、数据分析与最适浓度选择

1. 获取数据：记录每个浓度下阳性群体和阴性群体的平均荧光强度（MFI）。

2. 计算关键指标（任选其一，推荐染色指数SI）：

• 信噪比（S/N） = 阳性MFI / 阴性MFI

• 染色指数（SI） = （阳性MFI - 阴性MFI） / （2 × 阴性群体的标准差）

  SI更客观，因为它考虑了阴性群体的分布宽度。SI值最大时对应的浓度通常是最优浓度。

3. 绘制曲线：以抗体浓度为X轴（对数坐标），SI或S/N为Y轴，绘制曲线。

曲线会先快速上升（抗体不足区），然后进入一个平台期（最适饱和区），最后可能缓慢下降（抗体过量导致背景增高）。

4. 选择最适浓度：

• 理想选择：选择平台期起始点或平台期中段的浓度。例如，如果0.5 µg/test时SI已达平台期最大值，那么1.0 µg/test并未带来更好分离，就应选择0.5 µg/test作为工作浓度。

• 实践选择：在平台期范围内，有时会选择比理论最优浓度稍高一点的浓度，以应对样本间的小幅差异，确保稳定性。

四、注意事项

1. 对于CD3、CD4、CD8这类分群明显且间隔非常开的指标，只做细胞性质确定设门用的时候，可不进行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指标。

2. 样本状态：确保细胞活性高（>90%），死细胞会增加非特异性染色。考虑使用活死染料。

3. 关于全阳的细胞的滴定，可以在样本染色后加入未染色的细胞；对于表达量比较少的稀有细胞群体，在染色时，可加入该群细胞的父级细胞群的抗体。

4. 缓冲液：使用含蛋白（如BSA）的染色缓冲液阻断非特异性结合。

5. Fc受体阻断：对于表达Fc受体的细胞（如巨噬细胞、B细胞等），务必在染色前进行Fc受体阻断。

6. 记录与重复：详细记录所有使用的浓度、批号和实验条件。新批次抗体必须重新滴定，即使货号相同。

7. 固定：如果需要固定细胞，滴定实验应在固定后进行，因为固定可能影响荧光强度。

8. 实际实验过程中在一定的细胞密度范围内，抗体的染色指数只与抗体的浓度有关，与细胞密度无关。比如染色体系不变，细胞增加10倍，可以不用增加抗体浓度。

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