本文来源于微信公众：CGT未来   作者：细胞也迷茫

靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）能够实现高效地将mRNA递送至T细胞，从而在体内直接生成CAR-T细胞，而无需进行体外操作。这一策略在心脏纤维化、癌症和自身免疫性疾病等的临床前研究中显示出良好的治疗效果。尽管在不同研究中针对T细胞表面受体（如 CD2、CD4、CD5、CD7、CD8 或 CD4/8 双靶向组合）的tLNP介导的体内CAR-T细胞表现出不同的效率和性能，但这些差异背后的机制仍不清楚。

近日，来自宾夕法尼亚大学的研究团队，在bioRxiv上发表了文章“Rapid receptor internalization potentiates CD7-targeted lipid nanoparticles for efficient mRNA delivery to T cells and in vivo CAR T-cell engineering”。文章系统比较了多种靶向分子（如CD2、CD4、CD5、CD7、CD8）的tLNP递送效率，揭示了影响mRNA递送效率的关键机制，并明确了靶向CD7的tLNP在体内外均具有最高的递送效率和功能性CAR-T细胞生成能力。

研究内容
1、tLNP递送效率的系统比较
系统比较tLNP靶向不同T细胞表面受体（CD2、CD4、CD5、CD7、CD8和CD4/8组合）的mRNA递送效率，明确哪种靶向分子最优。

使用ZsGreen报告基因mRNA作为tLNP的负载物，在人类T细胞中进行递送实验，靶向CD7的tLNP在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中均表现出最高的递送效率和蛋白表达水平，aCD7/tLNP的ZsGreen阳性率高达76.4%，显著优于其他靶向分子。

2、受体内化能力决定tLNP递送效率
为了探讨递送效率差异背后的机制，研究比较了不同受体的表达量和内化能力。

使用公开的转录组数据和流式细胞术分析T细胞表面受体（CD2、CD4、CD5、CD7、CD8）的表达水平，CD2的表达量最高，是CD7和CD5的5倍，但CD2的mRNA递送效率远低于CD7和CD5。

使用IncuCyte® Fabfluor-pH抗体标记系统，定量分析抗体-受体复合物的内化动力学，CD7的抗体-受体复合物内化能力最强，显著高于CD5和CD2。CD7的内化能力与抗体克隆无关，是受体的固有特性。

3、 tLNP在PBMC中的递送效率
在PBMC中评估tLNP（靶向CD2、CD4、CD5、CD7、CD8或CD4/8组合）对T细胞的mRNA递送效率。

使用流式细胞术分析ZsGreen在不同免疫细胞亚群（T细胞、B细胞、单核细胞和NK细胞）中的表达。aCD7/tLNP在PBMC中仍表现出最高的T细胞递送效率，单核细胞在所有tLNP处理组中均显示较高的ZsGreen阳性率，而B细胞几乎没有ZsGreen表达，NK细胞在aCD7/tLNP处理下显示出较高的ZsGreen阳性率，符合CD7在NK细胞中的高表达水平。

4、 tLNP的体内CAR T细胞生成

使用人源化小鼠模型（PBMC-NSG小鼠），通过尾静脉注射aCD7/tLNP-ZsGreen，评估mRNA递送效率。在脾脏T细胞中，aCD7/tLNP处理后CD4⁺和CD8⁺ T细胞的ZsGreen阳性率分别为59.3%和88.7%，在外周血T细胞中，ZsGreen阳性率与脾脏中的结果相似，CD8⁺ T细胞的ZsGreen表达水平显著高于CD4⁺ T细胞，这与CD8⁺ T细胞表面更高的CD7表达量一致。

在PBMC-NSG人源化小鼠中，通过尾静脉注射aCD7/tLNP-CAR mRNA，评估CAR T细胞生成和B细胞清除效果。aCD7/tLNP-CAR处理后，CD4⁺和CD8⁺ T细胞的CAR表达率分别为33.3%和50.6%，显著高于靶向CD2的tLNP。aCD7/tLNP-CAR处理的小鼠脾脏中，CD20⁺ B细胞比例显著降低，仅为0.5%，相比对照组（4.1%-7.5%）减少了90%以上。免疫组织化学显示，aCD7/tLNP-CAR处理的小鼠脾脏中CD20⁺ B细胞几乎完全清除，同时观察到Granzyme B的强阳性染色，表明CAR T细胞具有强大的细胞毒性活性。

总结
这项研究为基于tLNP的体内CAR-T细胞疗法提供了重要的理论依据：优先选择内化快速的受体，如CD7，而非丰度高的。CD7之所以是最优的靶向受体，主要基于以下几点：
内化能力最强：CD7的抗体-受体复合物内化能力显著优于其他受体，是tLNP递送效率的关键决定因素。
广泛表达：CD7在CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和NK细胞中均有高表达，覆盖了更多的免疫细胞类型。
体内外表现优异：无论在体外T细胞实验、PBMC实验，还是人源化小鼠模型中，aCD7/tLNP均表现出最优的mRNA递送效率。
功能性强：通过aCD7/tLNP生成的CAR T细胞具有强大的抗原特异性杀伤能力，能够高效清除靶向细胞。