蛋白质组学基础——样本前处理详细操作流程
2026-02-25 来源:本站 点击次数:133
🔥做蛋白质组学总踩坑？90%问题出在样本前处理！这份保姆级流程快收好，从源头保证实验质量～
►Tips：本文涉及的方法仅供学习参考，请根据实际样本进行调整！
① 样本收集&保存：关键第一步！
（1）细胞样本（贴壁/悬浮细胞）
（2）组织样本（动物/植物/微生物）
（3）体液样本（血清/血浆/尿液/脑脊液）
② 蛋白裂解&提取：按需选方法
（2）具体操作技巧：分样本细化
③ 蛋白定量：标准化上样量
⚠️缺点：受EDTA影响（会螯合铜离子，降低显色强度）；部分蛋白（如组蛋白）反应弱，可能导致结果偏低。
⚠️缺点：严重受去污剂干扰（如RIPA裂解液中的 Triton X-100会让结果偏高/假阳性）；线性范围窄（20-1000μg/mL，高浓度需稀释）；显色不稳定（孵育后30分钟内必须测，否则吸光度下降）。
选择技巧：用含去污剂的裂解液（如RIPA）选BCA法；样本杂质少、想快速粗略定量选Bradford法！
④ SDS-PAGE 验证：检测蛋白质量（关键质控步！）
⑤ 胰酶酶切：将蛋白切成肽段（质谱检测关键步）
还原烷基化先加DTT或者TCEP还原二硫键（56℃孵育 30min），再加碘乙酰胺烷基化（避光室温 20min），防止蛋白复性影响酶切。
⑥ 肽段除盐：为质谱“扫清障碍”
💡最后总结：
►Tips：本文涉及的方法仅供学习参考，请根据实际样本进行调整！
① 样本收集&保存：关键第一步！
- 核心原则：全程低温（4℃/冰浴）操作，减少蛋白氧化、降解；按“单次实验用量”分装，避免反复冻融（≤3次）！
（1）细胞样本（贴壁/悬浮细胞）
- 贴壁细胞收集：
- 弃培养基，用预冷PBS（含1%双抗）轻柔洗2次（每次5mL，避免冲散细胞）；
- 加0.25%胰酶（覆盖细胞层即可），37℃孵育1-2min至细胞皱缩，加2倍体积含血清培养基终止消化；
- 用移液管吹打细胞（8-10次，避免产生过多气泡），收集至15mL离心管，4℃、1000rpm离心5min；
- 弃上清，加5mL预冷PBS重悬细胞，4℃、1000rpm离心5min（重复2次），最终留细胞沉淀（约1×10⁶-1×10⁷个细胞/管）。
- 悬浮细胞收集：
- 直接收集细胞悬液至15mL离心管，4℃、800rpm离心5min；
- 弃上清，加5mL预冷PBS重悬，4℃、800rpm离心5min（重复2次），留细胞沉淀。
- 保存方式：细胞沉淀加100μLPBS），分装至EP管，-80℃冻存（建议保存时间低于6个月），如长期保存需加10%DMSO，避免细胞破裂导致蛋白释放。
（2）组织样本（动物/植物/微生物）
- 动物组织（如肝脏、肌肉等）
- 取材后立即放入预冷生理盐水（含蛋白酶抑制剂）中，用无菌剪刀去除筋膜、脂肪，剪成1mm³小块（每块约芝麻大小，避免挤压损伤细胞）（如不立即处理，取样后立即-80℃冻存）；
- 取50-100mg组织块放入研磨管，加500μL预冷裂解液（按组织重量1:5比例加），冰浴下用组织研磨仪研磨（务必在冰浴中进行，避免升温）；
- 研磨后转移至EP管，冰上静置30min（让蛋白充分溶出），分装-80℃保存。
- 植物组织（如叶片、根系）
- 先将组织放入液氮中快速冷冻（10-20s），研磨成粉末（避免回温，可分批次加液氮保持低温）；
- 取100mg粉末，加600μL含 PVPP（聚乙烯聚吡咯烷酮，1%终浓度）的裂解液（去除植物多酚干扰），冰浴涡旋30s，4℃静置30min。
- 微生物（细菌/真菌）
- 细菌：培养至OD600=0.8-1.0，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，加500μL含溶菌酶（1mg/mL）的裂解液，37℃孵育20min（破坏细胞壁）；
- 真菌：收集菌丝体，加玻璃珠（0.5mm直径）和500μL裂解液，涡旋振荡（3000rpm，5min），破碎细胞壁。
（3）体液样本（血清/血浆/尿液/脑脊液）
- 血清/血浆：
- 血液采集后，血清管（无抗凝剂）室温静置30min，血浆管（加EDTA/K₂抗凝，1:10比例）立即颠倒混匀5次；
- 4℃、3000rpm离心15min，取上层血清/血浆（避免吸到中间白细胞层），分装至EP管（每管50-100μL）,-80℃冻存，避免反复冻融。
- 尿液/脑脊液：
- 收集新鲜样本，4℃、4000rpm离心20min，去除沉淀（如细胞、杂质）；
- 取上清，加蛋白酶抑制剂（1:100比例），分装后-80℃冻存（尿液需加0.05%叠氮钠防腐）。
- 踩坑预警：①组织研磨时未冰浴，温度升高导致蛋白变性；② 血清离心时转速过低（<2500rpm），未完全分离血细胞；③ 尿液未及时离心，细菌繁殖降解蛋白！
② 蛋白裂解&提取：按需选方法
- 核心目标：充分裂解细胞/组织，释放蛋白，同时抑制蛋白酶活性，避免蛋白修饰（如磷酸化丢失）。
（1）裂解液选择：按样本类型匹配
- 通用添加剂（必加！）：✅蛋白酶抑制剂cocktail（1:100比例，如PMSF、抑肽酶，抑制丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶等）；✅磷酸酶抑制剂（1:100比例，提取磷酸化蛋白时加，非磷酸化可省略）；
（2）具体操作技巧：分样本细化
- 细胞样本裂解
- 取收集的细胞沉淀，加预冷裂解液（按1×10⁶细胞加50μL裂解液，1×10⁷细胞加100μL），涡旋混匀10s；
- 冰浴孵育30min（每10min涡旋1次，促进蛋白溶出）；
- 4℃、12000rpm离心15min，取上清（含总蛋白），转移至新EP管（避免吸到管底沉淀，沉淀为细胞碎片）。
- 组织样本裂解
- 取研磨后的组织匀浆液（如100mg组织+500μL裂解液），冰浴孵育40min（每15min涡旋1次）；
- 4℃、13000rpm离心20min（转速高于细胞裂解，去除组织纤维沉淀），取上清。
- 微生物样本裂解：
- 细菌：溶菌酶孵育后，加裂解液冰浴30min，4℃、10000rpm离心15min；
- 真菌：玻璃珠破碎后，加裂解液冰浴40min，4℃、12000rpm离心20min，取上清。
③ 蛋白定量：标准化上样量
- 常用方法1：BCA法
⚠️缺点：受EDTA影响（会螯合铜离子，降低显色强度）；部分蛋白（如组蛋白）反应弱，可能导致结果偏低。
- 常用方法2：Bradford法
⚠️缺点：严重受去污剂干扰（如RIPA裂解液中的 Triton X-100会让结果偏高/假阳性）；线性范围窄（20-1000μg/mL，高浓度需稀释）；显色不稳定（孵育后30分钟内必须测，否则吸光度下降）。
选择技巧：用含去污剂的裂解液（如RIPA）选BCA法；样本杂质少、想快速粗略定量选Bradford法！
- 操作要点：做标准曲线→加样本孵育→测吸光度→计算蛋白浓度，确保所有样本浓度一致！
④ SDS-PAGE 验证：检测蛋白质量（关键质控步！）
- 核心目的：验证蛋白是否降解、有无杂带污染，确保后续酶切样本质量合格。
- 操作流程：
- 样品制备：按定量结果取20-30μg蛋白，加5×SDS上样缓冲液（含β-巯基乙醇），95℃煮沸5min使蛋白变性；
- 凝胶配制：制备5%浓缩胶（堆积蛋白）和10%-12%分离胶（按分子量分离，小分子选高浓度胶），室温静置20-30min待凝胶聚合；
- 上样电泳：加电泳缓冲液，先上蛋白Marker（用于分子量参考），再依次上样样本，80V跑浓缩胶（约30min，至溴酚蓝进入分离胶），转120V跑分离胶（60-90min，至溴酚蓝达凝胶底部）；
- 染色观察：凝胶用0.1%考马斯亮蓝或银染试剂摇床染色1-2h，再用脱色液（甲醇：水: 冰醋酸 = 4:5:1）脱色至条带清晰。
- 结果判断：✅合格：条带分布均匀、无明显拖尾（无降解）、无额外杂带（无污染）；❌不合格：出现弥散拖尾（蛋白降解）、条带偏少（提取不完全），需重新处理样本！
⑤ 胰酶酶切：将蛋白切成肽段（质谱检测关键步）
还原烷基化先加DTT或者TCEP还原二硫键（56℃孵育 30min），再加碘乙酰胺烷基化（避光室温 20min），防止蛋白复性影响酶切。
- 酶切操作：
- 按蛋白：胰酶=50:1或100:1的比例加酶（胰酶需用NH₄HCO₃缓冲液溶解）；
- 37℃恒温孵育12-16h（可放摇床轻微震荡，提升酶切效率）
- 终止反应加甲酸至终浓度1%（pH<3），终止胰酶活性。
⑥ 肽段除盐：为质谱“扫清障碍”
- 目的：去除酶切后残留的盐类、去污剂、未酶切完全的蛋白，避免干扰质谱信号。
- 常用方法：C18固相萃取柱（或自制StageTip）
- 常用步骤（可根据实际条件调整）：柱活化（加甲醇）→平衡（加0.1%甲酸水溶液）→上样肽段→清洗杂质（0.1%甲酸水溶液洗去杂质）→洗脱（80%乙腈+0.1%甲酸溶液收集肽段）
- 踩坑预警：洗脱后需真空浓缩（避免高温），将乙腈去除，再用0.1%甲酸复溶，控制复溶后的肽段浓度约1μg/μL！
💡最后总结：
- 样本前处理核心是“防降解、去杂质、准定量、高效酶切”，从样本到肽段的每一步都决定数据质量！后续质谱检测的重复性和准确性，全靠这步打底～
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