蛋白质组学基础：蛋白质糖基化修饰
2026-03-06 来源:本站 点击次数:64
糖蛋白质组学（Glycoproteomics）作为蛋白质组学的重要分支，聚焦于生物体内糖基化修饰蛋白的系统鉴定、定量分析及功能解析，是后基因组时代生命科学研究的前沿领域之一。糖基化作为最普遍且复杂的蛋白质翻译后修饰，指在酶的催化下，单糖或寡糖链共价连接到蛋白质特定位点的过程，这层“糖衣”不仅塑造蛋白质的空间构象，更调控其生物活性、细胞定位与分子互作，贯穿胚胎发育、免疫应答、信号传导等几乎所有核心生命过程，要了解这些功能，就需要知道精确的聚糖结构，以及其结构变异性、与蛋白质的连接位点以及这些位点的占据程度等。
聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于细胞上，它们分别与蛋白质或脂质共价结合。连接两个单糖的键称为糖苷键。聚糖主要通过两种主要连接方式与蛋白质相连，一种是聚糖通过天冬酰胺的侧链氮与蛋白质连接（N-连接聚糖），另一种是通过丝氨酸或苏氨酸的侧链氧连接（O-连接聚糖）。在N-连接糖基化的情况下，糖链一般与Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受体天冬酰胺结合。最常见的O-连接糖基化将单个单糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸结合，没有比较固定的连接基序，并且在GalNAc的情况下，这种单糖会进一步延伸以形成各种核心聚糖结构。
图1 哺乳动物中常见的蛋白质糖基化类型（Ieva Bagdonaite, et al., 2022）
对于聚糖的全面分析主要分为两个层次，第一个层次是仅对单个聚糖结构及其异构模式的详细分析，即糖组学，需要将聚糖从糖蛋白上释放出来，释放的聚糖可以进入质谱分析，也可以结合其他衍生化和分析技术，如荧光标记、全甲基化等，进行深入的结构表征。但由于聚糖已经不再结合蛋白质，所以无法研究特定于位点的信息。第二个层次是直接对糖蛋白上糖基化肽段、位点及糖型的表征，即糖蛋白质组学，保留聚糖-多肽的完整结合（图1）。从复杂生物样本中测定糖、糖肽及糖链的结构，可以借助核磁共振(NMR)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和毛细管电泳(CE)等多种不同的技术，而目前LC-MS/MS是糖组学和糖蛋白质组学研究最常用的方法。
图2 糖组学和糖蛋白质组学分析流程（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖组学分析
在糖组学分析中，使用N-聚糖切割酶从肽的天冬酰胺残基上切割，释放出的具有亲水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等与O-连接的糖肽和非糖基化肽分离。随后，O-连接的糖肽和非糖基化肽从C18 SPE中洗脱。由于缺乏对O-连接聚糖具有广泛特异性的去糖基化酶，因此O-连接聚糖的释放通常通过化学方法完成。用于释放O-聚糖的常见化学方法包括还原性β-消除、基于氨的非还原性β-消除或肼解。为了实现高灵敏度检测，O-连接和N-连接的聚糖组分在质谱分析前通常会进行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸等进行还原端标记。衍生化（特别是全甲基化）可增强游离聚糖的离子化效率，通过糖苷键断裂和跨环断裂，能够从串联质谱（MS/MS）谱图中提取更详细的结构信息。
图3 全甲基化可区分聚糖同分异构（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖蛋白质组学分析
由于糖基化修饰蛋白在生物样本中占比极低，糖肽仅占总肽段的5%以下，且易被大量高丰度非糖肽掩盖，直接进行质谱分析难以实现精准鉴定，因此需先通过富集技术特异性捕获糖肽，再结合质谱分析解析其详细信息。常用的富集技术各有侧重，其中凝集素亲和层析凭借凝集素与特定糖链结构的特异性识别能力，可针对性富集含对应糖链的糖肽，且操作简便、兼容性强；亲水相互作用色谱则基于糖肽与非糖肽的亲疏水性差异，利用亲水固定相将亲水性更强的糖肽保留并分离，尤其适合富集弱酸性糖肽和短链糖肽，两种技术可结合使用以提升富集效率与覆盖面。其他方法包括免疫亲和色谱法、酰肼法、硼酸法、二氧化钛富集法等。
图4 NEB凝集素亲和N-糖肽结合蛋白
质谱：糖组学和糖蛋白质组学研究的关键技术
质谱分析作为糖组学和糖蛋白质组学解析的核心环节，分析流程主要包括样本预处理→富集（糖/糖肽）→离子化→质谱分离与碎裂→谱图解析（图5）：
蛋白质糖基化研究的意义
1. 揭示生命基本规律
结语
糖组学与糖蛋白质组学正借助质谱技术，逐步揭示糖类分子在生命过程中的核心作用。从基础科研到临床应用，这一领域不仅拓展了我们对生命本质的认识，更为疾病诊断、药物研发提供了新的可能性。未来，随着质谱技术的不断升级和人工智能的引入，糖组学研究将迎来更广阔的应用前景。我们的PEAKS GlycanFinder软件可以提供糖组学和糖蛋白质组学质谱数据的准确、全面的定性、定量分析结果，可以联系我们深入交流，包括但不限于数据分析、实验方案设计等。
参考文献
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。
联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于细胞上，它们分别与蛋白质或脂质共价结合。连接两个单糖的键称为糖苷键。聚糖主要通过两种主要连接方式与蛋白质相连，一种是聚糖通过天冬酰胺的侧链氮与蛋白质连接（N-连接聚糖），另一种是通过丝氨酸或苏氨酸的侧链氧连接（O-连接聚糖）。在N-连接糖基化的情况下，糖链一般与Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受体天冬酰胺结合。最常见的O-连接糖基化将单个单糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）与蛋白质的丝氨酸或苏氨酸结合，没有比较固定的连接基序，并且在GalNAc的情况下，这种单糖会进一步延伸以形成各种核心聚糖结构。
图1 哺乳动物中常见的蛋白质糖基化类型（Ieva Bagdonaite, et al., 2022）对于聚糖的全面分析主要分为两个层次，第一个层次是仅对单个聚糖结构及其异构模式的详细分析，即糖组学，需要将聚糖从糖蛋白上释放出来，释放的聚糖可以进入质谱分析，也可以结合其他衍生化和分析技术，如荧光标记、全甲基化等，进行深入的结构表征。但由于聚糖已经不再结合蛋白质，所以无法研究特定于位点的信息。第二个层次是直接对糖蛋白上糖基化肽段、位点及糖型的表征，即糖蛋白质组学，保留聚糖-多肽的完整结合（图1）。从复杂生物样本中测定糖、糖肽及糖链的结构，可以借助核磁共振(NMR)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和毛细管电泳(CE)等多种不同的技术，而目前LC-MS/MS是糖组学和糖蛋白质组学研究最常用的方法。
图2 糖组学和糖蛋白质组学分析流程（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖组学分析
在糖组学分析中，使用N-聚糖切割酶从肽的天冬酰胺残基上切割，释放出的具有亲水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等与O-连接的糖肽和非糖基化肽分离。随后，O-连接的糖肽和非糖基化肽从C18 SPE中洗脱。由于缺乏对O-连接聚糖具有广泛特异性的去糖基化酶，因此O-连接聚糖的释放通常通过化学方法完成。用于释放O-聚糖的常见化学方法包括还原性β-消除、基于氨的非还原性β-消除或肼解。为了实现高灵敏度检测，O-连接和N-连接的聚糖组分在质谱分析前通常会进行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或邻氨基苯甲酸等进行还原端标记。衍生化（特别是全甲基化）可增强游离聚糖的离子化效率，通过糖苷键断裂和跨环断裂，能够从串联质谱（MS/MS）谱图中提取更详细的结构信息。
图3 全甲基化可区分聚糖同分异构（Asif Shajahan, et al., 2017）糖蛋白质组学分析
由于糖基化修饰蛋白在生物样本中占比极低，糖肽仅占总肽段的5%以下，且易被大量高丰度非糖肽掩盖，直接进行质谱分析难以实现精准鉴定，因此需先通过富集技术特异性捕获糖肽，再结合质谱分析解析其详细信息。常用的富集技术各有侧重，其中凝集素亲和层析凭借凝集素与特定糖链结构的特异性识别能力，可针对性富集含对应糖链的糖肽，且操作简便、兼容性强；亲水相互作用色谱则基于糖肽与非糖肽的亲疏水性差异，利用亲水固定相将亲水性更强的糖肽保留并分离，尤其适合富集弱酸性糖肽和短链糖肽，两种技术可结合使用以提升富集效率与覆盖面。其他方法包括免疫亲和色谱法、酰肼法、硼酸法、二氧化钛富集法等。
图4 NEB凝集素亲和N-糖肽结合蛋白
质谱：糖组学和糖蛋白质组学研究的关键技术
质谱分析作为糖组学和糖蛋白质组学解析的核心环节，分析流程主要包括样本预处理→富集（糖/糖肽）→离子化→质谱分离与碎裂→谱图解析（图5）：
1. 样本预处理
先对生物样本（组织、体液等）进行蛋白提取、酶解（糖蛋白质组学侧重糖肽释放，糖组学侧重游离糖链/糖缀合物解离），去除杂质干扰。
2. 特异性富集
糖蛋白质组学需采用合适的方法特异性捕获糖肽（排除非糖肽干扰）；糖组学可通过对应富集手段分离纯化糖链，提升检测灵敏度。
3. 离子化
采用适配糖/糖肽特性的电离方式，常用电喷雾电离（ESI）与液相色谱联用，适配复杂混合物、微量样本。
4. 质谱分离与碎裂
带电离子进入质谱仪后，经质量分析器（飞行时间、轨道阱等）按质荷比分离；再通过单一或组合碎裂模式（碰撞诱导解离、电子转移解离等）将母离子碎裂，采集相应的MS1和MS2谱图信息。
5. 谱图解析
结合专用软件，匹配糖库、肽段序列数据库，实现精准解析（糖蛋白质组学需鉴定糖蛋白、糖基化位点及糖链结构，糖组学侧重糖链精细结构解析）；可结合报告离子标记（TMT/iTRAQ）、非标定量（Label-free）等技术，完成不同状态下目标物的差异定量，为功能研究提供依据，以及PRM技术靶向验证目标糖肽。以上分析均可在PEAKS Glycanfinder中完成。
图5 基于质谱的糖蛋白质组学（a）和糖组学（b）流程
蛋白质糖基化研究的意义
1. 揭示生命基本规律
- 糖基化广泛参与细胞识别、信号传导、细胞黏附、免疫识别、胚胎发育等核心生命过程。
- 糖链结构的多样性与时空特异性，赋予蛋白质精细的功能调控能力，是生命复杂性的重要分子基础。
- 与核酸、蛋白质共同构成生命信息传递的 “第三条分子链”，完善对生命本质的认知。
- 许多重大疾病的发生、发展都伴随异常糖基化，如肿瘤、炎症、神经退行性疾病、代谢疾病等。
- 糖基化异常可影响蛋白稳定性、定位、互作，直接参与细胞癌变、侵袭转移、免疫逃逸等过程。
- 为从分子层面解释疾病机制提供了传统蛋白组学无法覆盖的新维度。
- 糖基化修饰灵敏度高、变化早，是理想的疾病标志物来源。
- 典型如AFP-L3（肝癌特异性糖基化异质体），已成为临床早期诊断与良恶性鉴别重要指标。
- 基于糖基化谱可实现更精细的疾病分型、预后判断、疗效监测，推动精准医学。
- 抗体、激素、疫苗等重组蛋白药物的疗效、半衰期、免疫原性高度依赖糖基化。
- 糖基化优化是生物药质量控制与药效提升的关键环节。
- 为靶向药物设计、抗感染疫苗、抗肿瘤疗法提供全新靶点与策略。
- 糖基化连接基因组、蛋白质组与表型组，填补了从基因到功能的关键缺口。
- 糖组学、糖蛋白质组学的发展，让生命科学从线性信息走向多维、动态、网络化的系统研究。
结语
糖组学与糖蛋白质组学正借助质谱技术，逐步揭示糖类分子在生命过程中的核心作用。从基础科研到临床应用，这一领域不仅拓展了我们对生命本质的认识，更为疾病诊断、药物研发提供了新的可能性。未来，随着质谱技术的不断升级和人工智能的引入，糖组学研究将迎来更广阔的应用前景。我们的PEAKS GlycanFinder软件可以提供糖组学和糖蛋白质组学质谱数据的准确、全面的定性、定量分析结果，可以联系我们深入交流，包括但不限于数据分析、实验方案设计等。
参考文献
- Shajahan A, Heiss C, Ishihara M, Azadi P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 2017 Jul;409(19):4483-4505. doi: 10.1007/s00216-017-0406-7. Epub 2017 Jun 6. PMID: 28585084; PMCID: PMC5498624.
- Bagdonaite, I., Malaker, S.A., Polasky, D.A. et al. Glycoproteomics. Nat Rev Methods Primers 2, 48 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00128-4
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。
联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
相关文章
更多 >