从发现到靶向蛋白质组学：基于MRMHR肽段定量完整工作流程
2026-03-26 来源:本站 点击次数:117
生物标志物在疾病诊断、监测、预后判断及治疗方案选择中发挥关键作用[1]。各类生物标志物的常规检测为疾病治疗、早期发现和疾病诊断分级提供了重要支撑。本文介绍了一套完整的数据分析工作流：基于ZenoTOF 7600系统(SCIEX)，利用PEAKS Studio 13.1软件(Bioinformatics Solutions Inc,BSI），实现从DDA的发现蛋白质组学，到基于MRMHR的靶向定量分析。
前言
蛋白质生物标志物备受关注的核心原因在于其是绝大多数生物学过程的主要执行者[2]。因此，对其进行深入分析可以揭示疾病的内在发生机制，有助于全面理解当下所研究的临床课题。为助力新型生物标志物的发现，我们基于PEAKS Studio软件与ZenoTOF 7600系统，构建了一套全面且精简的靶向蛋白质组学工作流。已有研究表明，借助Zeno阱可提升的序列覆盖率，ZenoTOF 7600系统既能实现全面的蛋白质表征，又能对治疗用蛋白药物进行灵敏定量[3]。
Figure 1. Comprehensive Workflow for MRMHR-based Peptide Quantitation in PEAKS Studio. A. PEAKS Studio supports discovery proteomics data acquired using ZenoTOF 7600 or 8600 systems. Using a novel tool, Transition List Generator, users can create the precursor list of desired targets and export it in a format directly supported by SCIEX OS. B. Output precursor list is imported and acquired using SCIEX MRMHR methodology. C. PEAKS Studio MRMHR data analysis includes automated, or user directed Target Peptide Quantification.
实验方法
Table 3. PEAKS Studio DDA search.
Table 4. PEAKS Studio MRMHR peptide quantification parameters.
研究结果
我们整合了发现与靶向定量工作流，利用TNF-α 标准蛋白验证了PEAKS Studio对MRMHR数据的分析能力。对TNF-α蛋白胰蛋白酶酶解产物进行DDA分析，结果表明，在PSM FDR<1%及protein score>20的过滤条件下，共检测到89个特异性肽段，蛋白序列覆盖率达64.81%。
将ZenoTOF 7600系统Zeno阱的高灵敏度优势，与从头测序辅助数据库搜索及PEAKS独特的PTM搜索算法结合，除未修饰肽段外，还可同时识别多种修饰肽段，最终将蛋白序列覆盖率提升至73.39%(Figure 2)。
Figure 2. Sequence coverage view in PEAKS Studio for TNFA_HUMAN (P01375).
在对目标肽段的定量分析与筛选过程中，需考虑以下要点：所选特征肽段需具备可与基质有效区分的独特序列，且该肽段不易发生化学修饰、不含翻译后修饰位点。通过Transition List Generator，筛选出3条未修饰的目标肽段，用于后续的MRMHR采集(Figure 3)。具体而言，用户可搜索并筛选目标母离子，确保所选母离子在LC-MS map view 中及选定的保留时间窗口内无信号重叠；此外，用户还可在注释谱图视图中对碎片离子进行验证。软件适配SCIEX OS中的自定义导出按钮，可将所选目标以兼容格式导出，用于MRMHR采集。
MRMHR数据无需转换格式可直接导入PEAKS Studio软件，并按照前文所述参数，通过内置的自动化非标记PRM工作流完成数据分析。
Figure 3. PEAKS Transition List Generator View. Transition List Generator supports data import from any DDA/DIA PEAKS analysis result, pre-created precursor list, and Spectral Library (including the .blib format). A compatible precursor list export for SCIEX OS is available.
我们基于3条特异性未修饰肽段完成了蛋白质定量分析，定量结果与预期符合，含量呈现递增趋势。
Figure 4. A. Target Peptide quantification.B. Target Protein quantification.
Figure 5. Peptide quantification with manual editing and validation.
讨论
本篇应用验证了一套联合PEAKS Studio软件与ZenoTOF 7600系统，可用于新型生物标志物灵敏发现与定量的研究策略。以TNF-α标准蛋白酶解产物为研究对象，通过PEAKS Studio13.1完成了一套精简准确的数据分析流程，包括发现蛋白质组学数据分析、已鉴定目标母离子筛选，以及最终通过自动化PRM工作流程实现靶向肽段定量。我们还进一步验证了PEAKS Studio在碎片离子编辑和保留时间的调整的灵活性，且所有分析结果完整透明、可追溯。
参考文献
[1]Wenk, D., Zuo, C., Kislinger, T. et al. Recent developments in mass-spectrometry-based targeted proteomics of clinical cancer biomarkers. Clin Proteom 21, 6 (2024). https://doi.org/10.1186/s12014-024-09452-1.
[2]Yaffe MB. Why geneticists stole cancer research even though cancer is primarily a signaling disease. Sci Signal.2019 Jan 22;12(565):eaaw3483. doi: 10.1126/scisignal.aaw3483. PMID: 30670634.
[3]Enhanced sensitivity for peptide quantification in a complex matrix using high-resolution LC-MS/MS. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13324-A.
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。
前言
蛋白质生物标志物备受关注的核心原因在于其是绝大多数生物学过程的主要执行者[2]。因此，对其进行深入分析可以揭示疾病的内在发生机制，有助于全面理解当下所研究的临床课题。为助力新型生物标志物的发现，我们基于PEAKS Studio软件与ZenoTOF 7600系统，构建了一套全面且精简的靶向蛋白质组学工作流。已有研究表明，借助Zeno阱可提升的序列覆盖率，ZenoTOF 7600系统既能实现全面的蛋白质表征，又能对治疗用蛋白药物进行灵敏定量[3]。
PEAKS Studio软件支持对ZenoTOF 7600系统的原始数据进行高灵敏度、高可靠性的组学数据分析，然后从DDA或数据非依赖采集(SWATH或ZT扫描)数据结果中筛选目标母离子，供下一步的靶向数据采集；然后通过PRM工作流，对目标母离子对应的肽段/蛋白质进行定量(Figure 1)。我们通过对TNF-α 蛋白的灵敏准确定量，验证了该流程的准确性。
Figure 1. Comprehensive Workflow for MRMHR-based Peptide Quantitation in PEAKS Studio. A. PEAKS Studio supports discovery proteomics data acquired using ZenoTOF 7600 or 8600 systems. Using a novel tool, Transition List Generator, users can create the precursor list of desired targets and export it in a format directly supported by SCIEX OS. B. Output precursor list is imported and acquired using SCIEX MRMHR methodology. C. PEAKS Studio MRMHR data analysis includes automated, or user directed Target Peptide Quantification.
实验方法
- 样品制备
- 色谱条件
Table 1. LC method.
- 质谱分析
Table 2. Source, gas, and MS conditions.
- 数据处理
Table 3. PEAKS Studio DDA search.
Table 4. PEAKS Studio MRMHR peptide quantification parameters.
我们整合了发现与靶向定量工作流，利用TNF-α 标准蛋白验证了PEAKS Studio对MRMHR数据的分析能力。对TNF-α蛋白胰蛋白酶酶解产物进行DDA分析，结果表明，在PSM FDR<1%及protein score>20的过滤条件下，共检测到89个特异性肽段，蛋白序列覆盖率达64.81%。
将ZenoTOF 7600系统Zeno阱的高灵敏度优势，与从头测序辅助数据库搜索及PEAKS独特的PTM搜索算法结合，除未修饰肽段外，还可同时识别多种修饰肽段，最终将蛋白序列覆盖率提升至73.39%(Figure 2)。
Figure 2. Sequence coverage view in PEAKS Studio for TNFA_HUMAN (P01375).
在对目标肽段的定量分析与筛选过程中，需考虑以下要点：所选特征肽段需具备可与基质有效区分的独特序列，且该肽段不易发生化学修饰、不含翻译后修饰位点。通过Transition List Generator，筛选出3条未修饰的目标肽段，用于后续的MRMHR采集(Figure 3)。具体而言，用户可搜索并筛选目标母离子，确保所选母离子在LC-MS map view 中及选定的保留时间窗口内无信号重叠；此外，用户还可在注释谱图视图中对碎片离子进行验证。软件适配SCIEX OS中的自定义导出按钮，可将所选目标以兼容格式导出，用于MRMHR采集。
MRMHR数据无需转换格式可直接导入PEAKS Studio软件，并按照前文所述参数，通过内置的自动化非标记PRM工作流完成数据分析。
Figure 3. PEAKS Transition List Generator View. Transition List Generator supports data import from any DDA/DIA PEAKS analysis result, pre-created precursor list, and Spectral Library (including the .blib format). A compatible precursor list export for SCIEX OS is available.
我们基于3条特异性未修饰肽段完成了蛋白质定量分析，定量结果与预期符合，含量呈现递增趋势。
Figure 4. A. Target Peptide quantification.B. Target Protein quantification.
除了基于优化的内部算法和训练模型自动选择用于母离子定量的碎片离子外，PEAKS Studio还支持用户根据自身需求，对碎片离子进行重新评估与筛选(Figure 5)。软件提供便捷的保留时间滑动窗口功能，可将碎片离子调整到滑块区间中心，进而实现对该范围内峰面积的精确积分。在此过程中，用户还可评估根据经验设置的保留时间窗口内的基质干扰。此外，软件还能自动可视化展示每个肽段的二级质谱(MS/MS)热图。
Figure 5. Peptide quantification with manual editing and validation.
讨论
本篇应用验证了一套联合PEAKS Studio软件与ZenoTOF 7600系统，可用于新型生物标志物灵敏发现与定量的研究策略。以TNF-α标准蛋白酶解产物为研究对象，通过PEAKS Studio13.1完成了一套精简准确的数据分析流程，包括发现蛋白质组学数据分析、已鉴定目标母离子筛选，以及最终通过自动化PRM工作流程实现靶向肽段定量。我们还进一步验证了PEAKS Studio在碎片离子编辑和保留时间的调整的灵活性，且所有分析结果完整透明、可追溯。
参考文献
[1]Wenk, D., Zuo, C., Kislinger, T. et al. Recent developments in mass-spectrometry-based targeted proteomics of clinical cancer biomarkers. Clin Proteom 21, 6 (2024). https://doi.org/10.1186/s12014-024-09452-1.
[2]Yaffe MB. Why geneticists stole cancer research even though cancer is primarily a signaling disease. Sci Signal.2019 Jan 22;12(565):eaaw3483. doi: 10.1126/scisignal.aaw3483. PMID: 30670634.
[3]Enhanced sensitivity for peptide quantification in a complex matrix using high-resolution LC-MS/MS. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13324-A.
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。
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