FSEC荧光检测尺寸排阻色谱技术的原理、标准实验流程、优势及应用
2026-02-25 来源:本站 点击次数:45
在细胞生命活动中，膜蛋白扮演着不可替代的核心角色，它参与 ATP 合成、离子与分子跨膜转运、细胞信号转导、酶促反应等几乎所有关键生理过程，编码膜蛋白的基因约占整个基因组的 30%，同时也是目前药物研发中最主要的靶点类别之一。
但长期以来，膜蛋白的结构生物学与功能研究始终面临诸多技术瓶颈：膜蛋白普遍存在天然表达水平低、强疏水性的特点，且在体外纯化过程中极易发生聚集、失活，难以长期维持稳定的折叠状态，这些问题极大限制了膜蛋白研究的推进。而荧光检测尺寸排阻色谱（Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography，简称 FSEC）技术的出现，为膜蛋白研究中的各类筛选难题提供了高效、快速的解决方案，成为当下膜蛋白结构与功能研究中不可或缺的核心工具。
一、FSEC 技术的核心原理
FSEC 技术是将尺寸排阻色谱（SEC）的分子筛分离能力，与高特异性的荧光检测技术相结合的分析方法。
其核心设计是将目标研究蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）进行共价融合表达，通过荧光检测器对 GFP 的特异性信号进行捕获，无需对样本进行复杂的预纯化操作，就能直接、实时地监测粗裂解液或纯化过程中目的蛋白的表达水平、分布状态与折叠情况。
在 FSEC 的层析图谱中，我们可以通过三个核心维度读取样本信息：洗脱峰的峰面积直接反映目的蛋白的表达水平；洗脱峰的出峰位置与洗脱体积，可对应计算出融合蛋白的近似分子量；而峰形与峰的分布，则直观体现了目的蛋白的单分散性与折叠状态。通常情况下，折叠正确、状态均一、单分散性好的蛋白，会呈现出对称的高斯型洗脱峰；而发生聚集、多分散、未正确折叠或状态不稳定的蛋白，则会出现多个不对称的洗脱峰，或在排阻体积位置出现高聚集峰。
二、FSEC 技术的标准实验流程
FSEC 实验的操作流程简便，无需复杂的样本前处理，核心流程如下：
1，重组表达载体构建：将目的基因克隆至带有 GFP 标签的表达载体中，可根据需求选择原核或真核表达体系；
2，蛋白表达：将构建好的载体转化至感受态细胞，或转染至真核细胞中，进行目的融合蛋白的诱导表达；
3，样本制备：收集表达后的细胞，通过裂解、去垢剂增溶处理后，经超高速离心去除不溶性杂质，收集的上清液即可作为 FSEC 的上样样本；
4，色谱检测：将制备好的样本直接上样至经对应缓冲液预平衡的 SEC 分子筛色谱柱，通过串联的荧光检测器与紫外检测器，同步采集信号并获得层析图谱，完成分析。
三、FSEC 技术的核心优势
相比传统的蛋白分析与筛选方法，FSEC 技术在膜蛋白研究中具备不可替代的优势，完美适配膜蛋白早期筛选的核心需求：
1，超高检测特异性，无杂蛋白干扰
FSEC 的检测信号仅来自于与目的蛋白融合的 GFP 标签，细胞内源性的杂蛋白无对应荧光信号，因此即使是未纯化的全细胞裂解液，也能精准捕获目的蛋白的信号，完全不受背景杂蛋白的干扰。
2，超高灵敏度，低样本量即可检测
该技术的荧光检测灵敏度可达 ng 级别，仅需几毫升的细胞培养物，就能完成一次完整的检测分析，大幅降低了样本制备的成本与工作量，尤其适合珍贵样本或难表达蛋白的早期筛选。
3，样本前处理简单，实验周期短
无需进行蛋白纯化、标签切除、样本浓缩等繁琐操作，细胞经裂解、去垢剂增溶和离心除杂后，即可直接上样检测，单样本检测可在半小时内完成，大幅缩短了筛选周期。
4，适配高通量筛选，提升研究效率
可搭配自动化样本处理系统，实现多克隆、多条件的批量筛选，一次性完成数十个样本的分析，极大提升了膜蛋白研究中条件优化的效率。
四、FSEC 技术在膜蛋白研究中的核心应用场景
凭借其独特的技术优势，FSEC 技术已广泛应用于膜蛋白研究的各个关键环节，成为膜蛋白结构解析、功能研究与药物靶点开发的核心筛选工具。
应用一：重组表达体系的高效优化与筛选
膜蛋白的异源表达是其研究的第一步，而表达载体的设计、标签的位置、克隆的选择，都会直接影响膜蛋白的表达量、折叠状态与稳定性。传统的筛选方法需要对每一个克隆进行蛋白纯化与鉴定，工作量极大、周期极长。
而 FSEC 技术可直接对不同克隆、不同载体构建的细胞裂解液进行检测，一次实验就能同步对比不同构建体的蛋白表达量、单分散性与折叠状态，快速筛选出最优的表达载体与克隆，大幅缩短了表达体系优化的周期。
图 2 原核表达膜蛋白的 FSEC 实验标准操作流程
应用二：膜蛋白纯化关键去垢剂的快速筛选
膜蛋白的疏水性特点，决定了其在体外环境中必须依赖去垢剂来维持水溶性与正确的折叠状态，因此去垢剂的选择，是决定膜蛋白纯化成败的核心关键。
传统的去垢剂筛选方法，需要先对目的蛋白进行纯化，再将蛋白分别置换至含不同去垢剂的缓冲液中，再逐一鉴定其稳定性与单分散性，整个过程耗时耗力，且会消耗大量的蛋白样本，成为膜蛋白纯化中的主要技术障碍。而 FSEC 技术可直接使用去垢剂增溶后的全细胞裂解液进行检测，无需完成完整的蛋白纯化流程，就能快速评估目标膜蛋白在不同去垢剂中的单分散性、折叠状态与稳定性，高效筛选出最适配的去垢剂类型与浓度，大幅降低了去垢剂筛选的时间与样本成本。
图 3 去垢剂溶解膜蛋白的原理示意图
应用三：基于 FSEC 的蛋白热稳定性评估（FSEC-TS）
蛋白的热稳定性是评估其折叠状态、缓冲液适配性、配体结合能力的核心指标，也是膜蛋白结晶与结构解析的重要参考依据。
基于 FSEC 的热稳定性检测技术（FSEC-Thermostability，简称 FSEC-TS），是将纳克级别的纯化或未纯化目的蛋白，在设定的温度梯度下进行孵育，再通过 SEC 色谱柱分离与荧光检测器采集信号，通过洗脱峰的变化分析蛋白的变性情况，最终获得蛋白的变性（熔解）温度。通过 FSEC-TS 技术，可快速筛选出能提升目的蛋白稳定性的缓冲液体系、添加剂、配体等条件，为膜蛋白的纯化、储存与结构解析提供关键的参考数据。
综上，FSEC 技术凭借其高特异性、高灵敏度、操作简便、可高通量筛选的核心优势，已成为膜蛋白研究中同源物筛选、表达载体优化、去垢剂筛选、热稳定性评估等环节的强大工具，助力科研人员突破膜蛋白研究的技术瓶颈，目前已有大量膜蛋白（包括 LeuT、ApcT、ASIC、P2X、GluA2、GluCl 等）的结构解析，均依赖 FSEC 技术完成了前期的关键筛选工作。
作为生命科学领域一站式解决方案服务商，优宁维可为广大科研工作者提供 FSEC 实验所需的高分辨率 Superdex/Superose 系列分子筛预装柱、层析系统配套设备、荧光标签表达载体、各类膜蛋白研究专用去垢剂等全系列产品与技术支持，助力您的膜蛋白研究工作顺利推进。随着技术的不断发展，除 FSEC 外，荧光偏振光谱、差示扫描荧光法等多种新型膜蛋白筛选技术也逐步被开发应用，为膜蛋白的结构与功能研究、药物靶点开发提供了更多高效的技术方案。
常见问题 FAQ
1，FSEC 技术只能用于膜蛋白的研究吗？
不是的。FSEC 技术的核心是通过 GFP 融合标签的荧光信号追踪目的蛋白的状态，除了膜蛋白之外，该技术同样适用于水溶性蛋白的表达水平、单分散性、稳定性与热稳定性的检测与筛选，尤其适合水溶性蛋白早期表达体系与纯化条件的快速优化。
2，做 FSEC 实验必须融合 GFP 标签吗？
常规的 FSEC 实验以 GFP 标签为核心检测标记，也是目前应用最广泛的方案，其优势在于 GFP 的荧光信号稳定、特异性强，且商业化的荧光检测器均有成熟的检测方法。除此之外，也可根据实验需求，使用 mCherry 等其他荧光蛋白标签，只需匹配对应激发 / 发射波长的荧光检测器即可完成检测。
3，FSEC 与普通 SEC-HPLC 的核心区别是什么？
普通 SEC-HPLC 主要通过紫外吸收（通常 280nm）进行检测，信号来自于蛋白的色氨酸、酪氨酸等残基，无法区分目的蛋白与杂蛋白，因此必须使用纯化后的蛋白样本进行检测；而 FSEC 通过特异性的荧光信号检测目的蛋白，不受杂蛋白干扰，粗裂解液即可直接上样，同时检测灵敏度远高于普通紫外检测，更适合早期的大规模筛选实验。
4，膜蛋白 FSEC 实验中，去垢剂的选择有什么基础原则？
首先，去垢剂需在实验浓度下无明显的荧光背景干扰，避免影响检测结果；其次，需根据目标膜蛋白的特性，选择临界胶束浓度（CMC）合适的去垢剂，保证其能充分溶解膜蛋白，同时不会导致蛋白变性失活；另外，SEC 色谱柱的分离缓冲液中，需保持与样本处理中一致的去垢剂类型与浓度，避免蛋白在色谱分离过程中发生聚集。
5，FSEC-TS 技术相比其他蛋白热稳定性检测方法有什么优势？
相比差示扫描量热法（DSC）、差示扫描荧光法（DSF）等技术，FSEC-TS 的核心优势在于：检测信号仅来自于目的蛋白，不受样本中杂蛋白、添加剂的干扰，即使是未纯化的粗裂解液也能完成检测；同时可直接通过洗脱峰的变化，区分蛋白的热聚集、降解等不同的变性行为，获得更全面的蛋白稳定性信息；且所需的蛋白样本量极低，纳克级别的蛋白即可完成一次完整的温度梯度检测。
但长期以来，膜蛋白的结构生物学与功能研究始终面临诸多技术瓶颈：膜蛋白普遍存在天然表达水平低、强疏水性的特点，且在体外纯化过程中极易发生聚集、失活，难以长期维持稳定的折叠状态，这些问题极大限制了膜蛋白研究的推进。而荧光检测尺寸排阻色谱（Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography，简称 FSEC）技术的出现，为膜蛋白研究中的各类筛选难题提供了高效、快速的解决方案，成为当下膜蛋白结构与功能研究中不可或缺的核心工具。
一、FSEC 技术的核心原理
FSEC 技术是将尺寸排阻色谱（SEC）的分子筛分离能力，与高特异性的荧光检测技术相结合的分析方法。
其核心设计是将目标研究蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）进行共价融合表达，通过荧光检测器对 GFP 的特异性信号进行捕获，无需对样本进行复杂的预纯化操作，就能直接、实时地监测粗裂解液或纯化过程中目的蛋白的表达水平、分布状态与折叠情况。
在 FSEC 的层析图谱中，我们可以通过三个核心维度读取样本信息：洗脱峰的峰面积直接反映目的蛋白的表达水平；洗脱峰的出峰位置与洗脱体积，可对应计算出融合蛋白的近似分子量；而峰形与峰的分布，则直观体现了目的蛋白的单分散性与折叠状态。通常情况下，折叠正确、状态均一、单分散性好的蛋白，会呈现出对称的高斯型洗脱峰；而发生聚集、多分散、未正确折叠或状态不稳定的蛋白，则会出现多个不对称的洗脱峰，或在排阻体积位置出现高聚集峰。
二、FSEC 技术的标准实验流程
FSEC 实验的操作流程简便，无需复杂的样本前处理，核心流程如下：
1，重组表达载体构建：将目的基因克隆至带有 GFP 标签的表达载体中，可根据需求选择原核或真核表达体系；
2，蛋白表达：将构建好的载体转化至感受态细胞，或转染至真核细胞中，进行目的融合蛋白的诱导表达；
3，样本制备：收集表达后的细胞，通过裂解、去垢剂增溶处理后，经超高速离心去除不溶性杂质，收集的上清液即可作为 FSEC 的上样样本；
4，色谱检测：将制备好的样本直接上样至经对应缓冲液预平衡的 SEC 分子筛色谱柱，通过串联的荧光检测器与紫外检测器，同步采集信号并获得层析图谱，完成分析。
图 1 FSEC 技术整体实验流程与检测原理示意图
三、FSEC 技术的核心优势
相比传统的蛋白分析与筛选方法，FSEC 技术在膜蛋白研究中具备不可替代的优势，完美适配膜蛋白早期筛选的核心需求：
1，超高检测特异性，无杂蛋白干扰
FSEC 的检测信号仅来自于与目的蛋白融合的 GFP 标签，细胞内源性的杂蛋白无对应荧光信号，因此即使是未纯化的全细胞裂解液，也能精准捕获目的蛋白的信号，完全不受背景杂蛋白的干扰。
2，超高灵敏度，低样本量即可检测
该技术的荧光检测灵敏度可达 ng 级别，仅需几毫升的细胞培养物，就能完成一次完整的检测分析，大幅降低了样本制备的成本与工作量，尤其适合珍贵样本或难表达蛋白的早期筛选。
3，样本前处理简单，实验周期短
无需进行蛋白纯化、标签切除、样本浓缩等繁琐操作，细胞经裂解、去垢剂增溶和离心除杂后，即可直接上样检测，单样本检测可在半小时内完成，大幅缩短了筛选周期。
4，适配高通量筛选，提升研究效率
可搭配自动化样本处理系统，实现多克隆、多条件的批量筛选，一次性完成数十个样本的分析，极大提升了膜蛋白研究中条件优化的效率。
四、FSEC 技术在膜蛋白研究中的核心应用场景
凭借其独特的技术优势，FSEC 技术已广泛应用于膜蛋白研究的各个关键环节，成为膜蛋白结构解析、功能研究与药物靶点开发的核心筛选工具。
应用一：重组表达体系的高效优化与筛选
膜蛋白的异源表达是其研究的第一步，而表达载体的设计、标签的位置、克隆的选择，都会直接影响膜蛋白的表达量、折叠状态与稳定性。传统的筛选方法需要对每一个克隆进行蛋白纯化与鉴定，工作量极大、周期极长。
而 FSEC 技术可直接对不同克隆、不同载体构建的细胞裂解液进行检测，一次实验就能同步对比不同构建体的蛋白表达量、单分散性与折叠状态，快速筛选出最优的表达载体与克隆，大幅缩短了表达体系优化的周期。
图 2 原核表达膜蛋白的 FSEC 实验标准操作流程
应用二：膜蛋白纯化关键去垢剂的快速筛选
膜蛋白的疏水性特点，决定了其在体外环境中必须依赖去垢剂来维持水溶性与正确的折叠状态，因此去垢剂的选择，是决定膜蛋白纯化成败的核心关键。
传统的去垢剂筛选方法，需要先对目的蛋白进行纯化，再将蛋白分别置换至含不同去垢剂的缓冲液中，再逐一鉴定其稳定性与单分散性，整个过程耗时耗力，且会消耗大量的蛋白样本，成为膜蛋白纯化中的主要技术障碍。而 FSEC 技术可直接使用去垢剂增溶后的全细胞裂解液进行检测，无需完成完整的蛋白纯化流程，就能快速评估目标膜蛋白在不同去垢剂中的单分散性、折叠状态与稳定性，高效筛选出最适配的去垢剂类型与浓度，大幅降低了去垢剂筛选的时间与样本成本。
图 3 去垢剂溶解膜蛋白的原理示意图
应用三：基于 FSEC 的蛋白热稳定性评估（FSEC-TS）
蛋白的热稳定性是评估其折叠状态、缓冲液适配性、配体结合能力的核心指标，也是膜蛋白结晶与结构解析的重要参考依据。
基于 FSEC 的热稳定性检测技术（FSEC-Thermostability，简称 FSEC-TS），是将纳克级别的纯化或未纯化目的蛋白，在设定的温度梯度下进行孵育，再通过 SEC 色谱柱分离与荧光检测器采集信号，通过洗脱峰的变化分析蛋白的变性情况，最终获得蛋白的变性（熔解）温度。通过 FSEC-TS 技术，可快速筛选出能提升目的蛋白稳定性的缓冲液体系、添加剂、配体等条件，为膜蛋白的纯化、储存与结构解析提供关键的参考数据。
综上，FSEC 技术凭借其高特异性、高灵敏度、操作简便、可高通量筛选的核心优势，已成为膜蛋白研究中同源物筛选、表达载体优化、去垢剂筛选、热稳定性评估等环节的强大工具，助力科研人员突破膜蛋白研究的技术瓶颈，目前已有大量膜蛋白（包括 LeuT、ApcT、ASIC、P2X、GluA2、GluCl 等）的结构解析，均依赖 FSEC 技术完成了前期的关键筛选工作。
作为生命科学领域一站式解决方案服务商，优宁维可为广大科研工作者提供 FSEC 实验所需的高分辨率 Superdex/Superose 系列分子筛预装柱、层析系统配套设备、荧光标签表达载体、各类膜蛋白研究专用去垢剂等全系列产品与技术支持，助力您的膜蛋白研究工作顺利推进。随着技术的不断发展，除 FSEC 外，荧光偏振光谱、差示扫描荧光法等多种新型膜蛋白筛选技术也逐步被开发应用，为膜蛋白的结构与功能研究、药物靶点开发提供了更多高效的技术方案。
常见问题 FAQ
1，FSEC 技术只能用于膜蛋白的研究吗？
不是的。FSEC 技术的核心是通过 GFP 融合标签的荧光信号追踪目的蛋白的状态，除了膜蛋白之外，该技术同样适用于水溶性蛋白的表达水平、单分散性、稳定性与热稳定性的检测与筛选，尤其适合水溶性蛋白早期表达体系与纯化条件的快速优化。
2，做 FSEC 实验必须融合 GFP 标签吗？
常规的 FSEC 实验以 GFP 标签为核心检测标记，也是目前应用最广泛的方案，其优势在于 GFP 的荧光信号稳定、特异性强，且商业化的荧光检测器均有成熟的检测方法。除此之外，也可根据实验需求，使用 mCherry 等其他荧光蛋白标签，只需匹配对应激发 / 发射波长的荧光检测器即可完成检测。
3，FSEC 与普通 SEC-HPLC 的核心区别是什么？
普通 SEC-HPLC 主要通过紫外吸收（通常 280nm）进行检测，信号来自于蛋白的色氨酸、酪氨酸等残基，无法区分目的蛋白与杂蛋白，因此必须使用纯化后的蛋白样本进行检测；而 FSEC 通过特异性的荧光信号检测目的蛋白，不受杂蛋白干扰，粗裂解液即可直接上样，同时检测灵敏度远高于普通紫外检测，更适合早期的大规模筛选实验。
4，膜蛋白 FSEC 实验中，去垢剂的选择有什么基础原则？
首先，去垢剂需在实验浓度下无明显的荧光背景干扰，避免影响检测结果；其次，需根据目标膜蛋白的特性，选择临界胶束浓度（CMC）合适的去垢剂，保证其能充分溶解膜蛋白，同时不会导致蛋白变性失活；另外，SEC 色谱柱的分离缓冲液中，需保持与样本处理中一致的去垢剂类型与浓度，避免蛋白在色谱分离过程中发生聚集。
5，FSEC-TS 技术相比其他蛋白热稳定性检测方法有什么优势？
相比差示扫描量热法（DSC）、差示扫描荧光法（DSF）等技术，FSEC-TS 的核心优势在于：检测信号仅来自于目的蛋白，不受样本中杂蛋白、添加剂的干扰，即使是未纯化的粗裂解液也能完成检测；同时可直接通过洗脱峰的变化，区分蛋白的热聚集、降解等不同的变性行为，获得更全面的蛋白稳定性信息；且所需的蛋白样本量极低，纳克级别的蛋白即可完成一次完整的温度梯度检测。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Series S Sensor Chip CM5 | BR100530 | EA |
| Series S Sensor chip CM7 | 28953828 | EA |
| Amine Coupling Kit | BR100050 | EA |
| Series S Sensor Chip SA | BR100531 | EA |
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