多能干细胞（包括胚胎干细胞ES和诱导多能干细胞iPS）是再生医学、疾病建模和药物筛选研究的重要工具。然而，这些细胞的冻存与复苏过程充满挑战——不恰当的冻存方法可能导致细胞活性骤降、分化率升高，甚至珍贵细胞系的永久丢失。本文将详细介绍进行多能干细胞冻存与复苏的专业方法，帮助您提升细胞保存效率。

• 为什么多能干细胞冻存如此特殊？

多能干细胞的冻存不仅仅是“降温保存”那么简单。它们对温度变化、渗透压波动和冰晶形成极为敏感。传统含血清冻存液中的动物源性成分不仅存在批间差风险，还可能引入外源因子，影响细胞性能和后续应用。无血清细胞冻存专用液采用化学成分明确的配方，不含动物源性成分，确保了稳定性和一致性，同时减少分化风险，显著提高复苏后细胞活率与多能性维持。

• 多能干细胞的冻存方法（逐步指南）

一、准备工作
1、细胞状态确认：确保冻存前细胞处于对数生长期，形态良好，集落边界清晰
2、试剂准备：无血清细胞冻存专用液提前从4℃取出，室温平衡
3、材料准备：预冷冻存管、细胞刮刀或温和解离试剂
二、冻存步骤
1. 准备对数期生长的干细胞，加入人多能干细胞消化液（AC-1001008）消化 3~5 min，用 2mL
人多能干细胞培养基（AC-1001000）制备成细胞悬液；
2. 1200 rpm 3min 离心，弃上清，用 1.5-2mL ES/iPS 细胞冻存液重悬细胞，细胞密度 1×106~1×107/mL；
3. 转移至冻存管中，无需程序降温，直接将待冻存细胞置于 -80℃过夜，后转移至液氮中长期保存，冻存时注意直立放置冻存管；

• 复苏：唤醒沉睡的干细胞

复苏过程对细胞造成的热应激和渗透应激同样不容忽视。以下是使用无血清冻存专用液冻存的细胞的复苏指南：
1.复苏步骤
第1步：快速解冻
从液氮中取出冻存管，立即置于37℃水浴，轻轻摇动直至完全解冻（约1-2分钟）
注意：避免水浴污染管口区域
第2步：稀释与离心
将细胞悬液缓慢滴入5-10倍体积的预温培养基中，轻柔混匀
300g离心5分钟，去除含冻存液的上清液。
第3步：重悬与接种
用完全培养基重悬细胞，接种至基质胶包被的培养皿复苏后24小时内可添加10μM Y-27632（ROCK抑制剂）减少凋亡。
第4步：复苏后监测
24小时后观察细胞贴壁情况
48小时后首次换液，去除未贴壁细胞

• 常见问题与解决方案 

Q1：复苏后细胞活率低？
可能原因：解冻速度过慢、冻存前细胞状态不佳
解决方案：确保快速解冻；优化冻存前细胞培养条件
Q2：复苏后细胞分化率升高？
可能原因：冻存过程应激诱导分化
解决方案：使用埃泽思无血清冻存液，其配方特别添加多能性维持因子；控制冻存细胞密度在推荐范围
Q3：能否直接复苏后扩增？
建议：复苏后第一代主要用于恢复细胞状态，第二代开始可用于实验或进一步扩增

•   权威参考文献

1、Hunt CJ et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells: a systematic review of freezing and thawing protocols. Cryobiology. 2017.
2、Baharvand H et al. Optimizing human embryonic stem cells freezing culture density for efficient recovery. Stem Cells Dev. 2010.
3、Li Y et al. Chemically defined strategies for human pluripotent stem cell maintenance and expansion. Cell Regen. 2021.
 
专业技术支持
作为细胞治疗全流程原料生产商，埃泽思Applied cell特别推出无血清细胞冻存专用液，专为ES/iPS细胞优化设计，不仅提供高品质的无血清细胞冻存液，还为客户提供全面的技术支持。我们的产品经过严格测试，确保：
高复苏率：平均复苏活率>90%
多能性保持：复苏后细胞保持正常的核型和多能性标志物表达
无动物源性：完全化学成分明确，无外源因子风险
批次一致性：严格质量控制，确保不同批次间性能稳定

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公司介绍
 
 
 
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