本文来源于微信公众： 生物世界 作者：生物世界

撰文丨王聪
编辑丨王多鱼
排版丨水成文

经过基因工程改造、重编程以表达嵌合抗原受体（CAR）的 CAR-T 细胞疗法，已彻底改变了癌症治疗格局，目前，美国 fDA 已批准了款 CAR-T 细胞疗法，用于治疗包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤在内的复发或难治性癌症。最近，CAR-T 细胞疗法还在系统性红斑狼疮等多种自身免疫疾病中展现了强大的治疗潜力。

通过基因组编辑增强 T 细胞功能，无论是通过破坏内源性基因还是精确插入 DNA 片段，都已展现出相当大的前景。然而，CAR-T 细胞的体外制造过程周期漫长且成本高昂，限制了这些疗法的可及性。

在体内原位生成 CAR-T 细胞，即所谓的 in vivo CAR-T 技术，能够克服上述障碍，但目前的方法要么依赖于持续时间有限的瞬时表达（使用 LNP 递送 mRNA ），要么依赖于缺乏特异性的 DNA 负载随机整合（慢病毒载体递送 DNA）。

2026 年 3 月 18 日，加州大学旧金山分校研究人员在国际顶尖学术期刊 Nature 上发表了题为：In vivo site-specific engineering to reprogram T cells 的研究论文。

该研究开发了一种双载体系统——使用包膜递送载体（EDV）和腺相关病毒（AAV）分别递送 CRISPR–Cas9 RNP 和 CAR 模板，将 CAR 高效且特异性整合到 T 细胞的 TRAC 位点，在人源化小鼠模型的 B 细胞发育不全、血液系统恶性肿瘤和实体瘤中体内生成了治疗水平的 CAR-T 细胞。这些发现为更高效、更精准且更广泛可及的 T 细胞疗法开辟了新途径。

核心原理：双载体系统实现体内精准改造
在这项最新研究中，研究团队开发了一套创新的“双载体系统”——
1、EDV（包膜递送载体）：负责将 CRISPR-Cas9 基因编辑工具（以 RNP 的形式）精准递送到 T 细胞中，定点切割 T 细胞受体基因（TRAC 位点）。
2、AAV（腺相关病毒）：携带 CAR 基因模板（以 DNA 的形式），在切割位点通过同源定向修复机制，将 CAR 精准插入 TRAC 位点。

这种设计的精妙之处在于，CAR 没有自带启动子，而是利用 T 细胞自身的 TRAC 启动子来驱动表达，确保了 CAR 只在 T 细胞中特异性表达，避免了误伤其他细胞的风险。利用 T 细胞自身的 TRAC 的启动子来驱动 CAR 的表达，其表达水平也更接近天然 T 细胞激活的模式，可能有助于 CAR-T 细胞在体内更好地维持功能、减少耗竭，从而更持久地发挥抗肿瘤作用。此外，TRAC 位点也是一个被广泛验证了的 T 细胞编辑的“安全港”位点，在此位点插入外源基因，对 T 细胞的干扰更小、安全性更高。

技术优化：三大屏障的攻克
为了提升体内编辑的效率和安全性，研究团队对载体进行了三项关键优化——
1、中和抗体抵抗：通过定向进化改造 AAV 病毒衣壳，使其能抵抗人体血清中的中和抗体，确保 CAR 的有效递送。
2、T 细胞特异性靶向：改造 EDV，使其表面展示了抗 CD3 抗体，从而精准结合到 T 细胞，同时激活 T 细胞促进其增殖，为基因编辑创造有利条件。
3、脱靶风险控制：优化后的 AAV-hT7 载体几乎不感染造血干细胞和肿瘤细胞，从源头避免了脱靶基因编辑可能导致的潜在白血病风险或肿瘤抗原丢失。

实验验证：高效抗肿瘤效果
在多种人源化小鼠模型中，这种优化的 EDV/AAV 双载体系统成功在体内生成了大量 CAR-T 细胞，占脾脏 T 细胞的近 20%。在 B 细胞发育不全的人源化小鼠模型中，这些体内直接生成的 CAR-T 细胞实现了完全的 B 细胞清除；在 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、骨髓瘤以及肉瘤的人源化小鼠模型中，这些体内直接生成的 CAR-T 细胞有效控制了肿瘤生长。进一步细胞表型分析显示，这些体内直接生成的 CAR-T 细胞高度增殖，并保持了记忆细胞特征，预示着持久的治疗效果。

这些结果表明，优化的 EDV/AAV 双载体系统可实现体内定点的 CAR-T 细胞生成，从而在体内原位重编程 T 细胞，以对多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤模型产生抗肿瘤细胞治疗反应，这确立了体内 TRAC-CAR-T 细胞生成是一种极具前景的细胞治疗平台。

意义与展望
这项研究首次实现了在体内对原代人类 T 细胞进行大片段 DNA 的靶向定点整合，标志着 in vivo CAR-T 技术迈向了更精准、更可控的新时代，其潜在优势包括——

• 降低成本与时间：省去复杂的分离、体外扩增和制造流程；
• 提升可及性：有望成为“现货型”疗法，惠及更广泛的患者；
• 增强安全性：精准的 T 细胞特异性编辑，降低潜在脱靶风险。

总的来说，该研究展示了在活体中的特定位点实现细胞特异性插入大片段 DNA 的新技术。至关重要的是，该研究克服了在患者体内生成 CAR-T 细胞用于治疗应用所面临的主要障碍，这对于开发无需细胞分离和制造的细胞疗法具有重要意义。研究团队认为，这一进展将对细胞疗法试验的设计和实施产生重大影响，并改善患者获得前沿 CAR-T 细胞治疗的机会。