THUNDER™ cAMP TR-FRET检测试剂盒的原理、优势及实验优化攻略
2026-06-02 来源:本站 点击次数:28
环磷酸腺苷（cAMP）是 G 蛋白偶联受体（GPCR）信号通路中核心的细胞内第二信使，其胞内浓度的动态变化，可直接反映 GPCR 激动剂、拮抗剂的药理活性，是 GPCR 靶向药物筛选与基础信号研究的关键检测指标。传统 cAMP 检测方法普遍存在灵敏度低、背景干扰高、操作繁琐、通量受限等问题，难以适配高通量药物筛选的需求。
THUNDER™ cAMP TR-FRET 检测试剂盒基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，采用均相免洗检测体系，兼具高灵敏、快检测、高稳定的特点，为 GPCR 药理学研究与高通量筛选提供了标准化解决方案。
一、THUNDER™ 检测原理与核心优势
试剂盒采用竞争性免疫检测原理，依托双荧光标记体系实现 cAMP 精准定量：
1.双荧光标记系统
供体：铕螯合物标记链霉亲和素（Eu-SA）与生物素化 cAMP（Biotin-cAMP）结合形成复合物；
受体：远红荧光标记抗 cAMP 单克隆抗体（FR-anti-cAMP）
2.竞争结合机制
无游离 cAMP 时，抗体与 Eu-SA/Biotin-cAMP 复合物结合，触发 TR-FRET 并在 665nm 产生强信号；样本中游离 cAMP 浓度越高，竞争性结合抗体的能力越强，TR-FRET 信号随之减弱，信号强度与 cAMP 浓度呈负相关。
核心优势
快速高效：全程仅需 1 小时即可完成检测；
信号稳定：室温下信号可稳定维持 18 小时以上，实验安排更灵活；
广谱适配：同时支持 Gs、Gi 通路介导的 cAMP 检测；
均相免洗：无需洗板，减少操作误差，完美适配高通量筛选。
二、实验优化攻略：提升灵敏度与重复性
1. 细胞密度调整
384 孔板推荐细胞密度：1000–10000 细胞 / 孔，受体低表达细胞可适当提高密度。
优化方法：通过 Forskolin 浓度梯度与细胞密度交叉滴定，选取信号背景比（S/B）最高、响应值匹配标准曲线线性区间的密度（示例最优密度：4000 细胞 / 孔）。
2. 关键试剂使用规范
IBMX：推荐浓度 0.5mM，抑制磷酸二酯酶活性，避免 cAMP 降解，具体浓度按细胞模型优化；
Forskolin：使用 EC50 浓度，预实验确定，保证信号处于标准曲线线性范围；
激动剂 / 拮抗剂：按 EC50/IC50 设置梯度，避免超出标准曲线动态范围。
3. 孵育条件优化
细胞刺激：室温或 37℃孵育 30 分钟，可在 15–60 分钟内梯度优化；
检测孵育：室温孵育 1 小时即可读数，最长可延长至 18 小时，不影响结果稳定性。
三、标准曲线制备与数据定量方法
1. 标准曲线制备
梯度稀释：使用试剂盒 50μM cAMP 标准品，10 倍系列稀释，设置 10 个梯度（3×10⁻¹¹–3×10⁻⁷ M），每浓度 3 复孔
数据拟合：采用 4 参数逻辑方程（4PL）拟合，结合 1/Y² 数据加权，以 **665nm/615nm 比值（Ratio×1000）** 计算 cAMP 浓度。
2. 样本定量
将样本 TR-FRET 信号比值代入标准曲线方程，直接换算得到样本中 cAMP 的实际浓度。
四、实际应用案例
1.Gs 通路 cAMP 检测（U266B1 细胞）
在表达内源性 Gs 偶联腺苷 A2a 受体的 U266B1 细胞（2000 细胞 / 孔）中，检测激动剂 NECA 的浓度 - 反应曲线，EC₅₀为 122nM，信号完全匹配标准曲线定量范围。
在表达 Gi 偶联人 OP3 受体的 CHO 细胞（2500 细胞 / 孔）中，检测激动剂 DAMGO 的浓度 - 反应曲线，EC₅₀为 3nM，检测结果精准可靠。
THUNDER™ cAMP TR-FRET 检测试剂盒基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，采用均相免洗检测体系，兼具高灵敏、快检测、高稳定的特点，为 GPCR 药理学研究与高通量筛选提供了标准化解决方案。
一、THUNDER™ 检测原理与核心优势
试剂盒采用竞争性免疫检测原理，依托双荧光标记体系实现 cAMP 精准定量：
1.双荧光标记系统
供体：铕螯合物标记链霉亲和素（Eu-SA）与生物素化 cAMP（Biotin-cAMP）结合形成复合物；
受体：远红荧光标记抗 cAMP 单克隆抗体（FR-anti-cAMP）
2.竞争结合机制
无游离 cAMP 时，抗体与 Eu-SA/Biotin-cAMP 复合物结合，触发 TR-FRET 并在 665nm 产生强信号；样本中游离 cAMP 浓度越高，竞争性结合抗体的能力越强，TR-FRET 信号随之减弱，信号强度与 cAMP 浓度呈负相关。
核心优势
快速高效：全程仅需 1 小时即可完成检测；
信号稳定：室温下信号可稳定维持 18 小时以上，实验安排更灵活；
广谱适配：同时支持 Gs、Gi 通路介导的 cAMP 检测；
均相免洗：无需洗板，减少操作误差，完美适配高通量筛选。
二、实验优化攻略：提升灵敏度与重复性
1. 细胞密度调整
384 孔板推荐细胞密度：1000–10000 细胞 / 孔，受体低表达细胞可适当提高密度。
优化方法：通过 Forskolin 浓度梯度与细胞密度交叉滴定，选取信号背景比（S/B）最高、响应值匹配标准曲线线性区间的密度（示例最优密度：4000 细胞 / 孔）。
2. 关键试剂使用规范
IBMX：推荐浓度 0.5mM，抑制磷酸二酯酶活性，避免 cAMP 降解，具体浓度按细胞模型优化；
Forskolin：使用 EC50 浓度，预实验确定，保证信号处于标准曲线线性范围；
激动剂 / 拮抗剂：按 EC50/IC50 设置梯度，避免超出标准曲线动态范围。
3. 孵育条件优化
细胞刺激：室温或 37℃孵育 30 分钟，可在 15–60 分钟内梯度优化；
检测孵育：室温孵育 1 小时即可读数，最长可延长至 18 小时，不影响结果稳定性。
三、标准曲线制备与数据定量方法
1. 标准曲线制备
梯度稀释：使用试剂盒 50μM cAMP 标准品，10 倍系列稀释，设置 10 个梯度（3×10⁻¹¹–3×10⁻⁷ M），每浓度 3 复孔
数据拟合：采用 4 参数逻辑方程（4PL）拟合，结合 1/Y² 数据加权，以 **665nm/615nm 比值（Ratio×1000）** 计算 cAMP 浓度。
2. 样本定量
将样本 TR-FRET 信号比值代入标准曲线方程，直接换算得到样本中 cAMP 的实际浓度。
四、实际应用案例
1.Gs 通路 cAMP 检测（U266B1 细胞）
在表达内源性 Gs 偶联腺苷 A2a 受体的 U266B1 细胞（2000 细胞 / 孔）中，检测激动剂 NECA 的浓度 - 反应曲线，EC₅₀为 122nM，信号完全匹配标准曲线定量范围。
在表达 Gi 偶联人 OP3 受体的 CHO 细胞（2500 细胞 / 孔）中，检测激动剂 DAMGO 的浓度 - 反应曲线，EC₅₀为 3nM，检测结果精准可靠。
配套产品
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品名 |
货号 |
规格 |
|
THUNDER™cAMP TR-FRET Assay Kit |
1000 pionts |
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Phospho-JNK1/2/3 (T183/Y185) |
500 pionts |
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Total JNK1/2/3 |
500 pionts |
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