期刊：Cell Reports Medicine
影响因子：10.6
通讯作者：四川大学华西医院血液内科牛挺/赵艾琳/吴奕君团队
伯豪产品服务：伯优^®FFPE样本细胞核分离试剂盒（#52301-10）

导语
黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤是最常见的结外边缘区B细胞淋巴瘤，其发生发展高度依赖于肿瘤微环境（LME）中的免疫与基质细胞网络。然而，由于肿瘤发生部位多样（胃、眼附属器、甲状腺、肺等）、遗传背景复杂（BIRC3/MALT1融合、TNFAIP3突变等），MALT淋巴瘤的微环境异质性及其临床意义长期未被系统解析。传统的Bulk转录组分析虽能揭示整体表达谱变化，却无法区分恶性细胞与微环境细胞的各自贡献；单细胞技术虽能解析细胞异质性，但在FFPE样本中应用困难；空间转录组则能提供组织原位信息，但通量与分辨率有限。如何整合这些技术，构建一个跨组织、多层次的MALT淋巴瘤微环境图谱，是该领域亟待解决的核心问题。

2026年4月，《Cell Reports Medicine》 发表了一项题为“Cross-tissue atlas of mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas reveals intratumoral heterogeneity and microenvironmental subtypes”的研究。该研究整合了Bulk RNA-seq、单细胞核RNA-seq（snRNA-seq）和空间转录组技术，对来自胃、眼附属器等多个部位的89例MALT淋巴瘤样本进行了系统性分析，首次构建了MALT淋巴瘤的LME三维图谱，并识别出三种具有不同细胞组成、信号通路活性及治疗敏感性的微环境亚型。本文将从RNA-seq技术整合视角，详细解读该研究如何通过多层次的转录组分析，逐步揭示MALT淋巴瘤的微环境异质性及其临床转化价值。

产品服务
伯优^®FFPE样本细胞核分离试剂盒（#52301-10）

主要研究、Bulk RNA-seq奠定分型基础：三种LME亚型的首次识别
1.1 大规模多中心队列的整合与批次校正
研究首先回顾性收集了四川大学华西医院2020年1月至2023年6月期间经病理确诊的89例MALT淋巴瘤FFPE样本（WCH队列），其中胃部38例、眼附属器30例，其余来自肺、腮腺、甲状腺等部位。考虑到回顾性队列缺乏正常对照，研究者进一步纳入两个公共Bulk RNA-seq队列（GSE171059、GSE218618），分别包含21例和10例眼附属器MALT淋巴瘤及其匹配的正常组织。最终整合数据集包含145个样本，其中120例肿瘤、25例正常对照（图1B）。肿瘤样本中，眼附属器占50.8%（61例），胃部占31.7%（38例）。临床信息完整的110例患者中，55.5%为男性，52.7%年龄≥60岁，62.7%为Ann Arbor I期（图1C）。

为消除不同测序平台和实验批次带来的技术差异，研究采用ComBat算法进行批次效应校正。校正后的主成分分析（PCA）显示，不同队列和不同解剖部位的样本均匀混合（图S1A），为后续联合分析奠定了可靠基础。与正常组织相比，MALT淋巴瘤样本显著上调B细胞相关基因（MS4A1、CD79A、PAX5），并富集E2F靶点、G2/M检查点等增殖通路以及未折叠蛋白反应、DNA修复等肿瘤相关通路（图S1B、S1C）。这些结果表明，整合后的Bulk数据能够有效捕捉MALT淋巴瘤的恶性转化特征。

1.2 基于单细胞特征的微环境分型
传统的Bulk分型往往直接对所有基因进行聚类，但这样容易受到恶性B细胞高表达基因的干扰，掩盖微环境的真实异质性。本研究采取了一种创新的策略：先通过snRNA-seq定义微环境细胞亚群的特征基因，再将这些特征投射回Bulk数据中进行分型。具体而言，研究者从snRNA-seq获得的非B细胞亚群（T细胞、髓系细胞、基质细胞等）中提取了差异表达基因作为微环境特征集，排除了B细胞相关基因，从而避免肿瘤细胞丰度对微环境信号的稀释。

随后，研究使用GSVA（Gene Set Variation Analysis）对120个肿瘤样本进行特征评分，评分结果经min-max归一化后，采用非负矩阵分解（NMF）进行无监督聚类。NMF的秩（rank）通过残差平方和的拐点确定为3（图S4B）。聚类结果稳定识别出三种LME亚型（图1G）：
- LME1（间质型）：高表达TGF-β、细胞外基质（ECM）和血管生成通路，富集内皮细胞、周细胞、中性粒细胞和Mac_MARCO巨噬细胞（图1H、图S5D）。
- LME2（炎症型）：高表达干扰素信号和免疫激活通路（TNF-α、IFN-γ），富集T细胞、树突状细胞和Mac_SPARC巨噬细胞（图1H、图S5D）。
- LME3（耗竭型）：微环境特征全局低表达，细胞组成稀疏，类似“冷肿瘤”状态。

重要的是，这种基于微环境特征的分型与使用已报道的泛淋巴瘤微环境基因集（Kotlov et al., Cancer Discovery 2021）得到的结果高度一致（图S4C），验证了分型的稳健性。

1.3 临床关联与预后意义
LME亚型与临床特征存在显著关联：胃部MALT淋巴瘤和BIRC3/MALT1融合在LME1中更为常见（图1I）。生存分析显示，LME2、晚期（III/IV期）和BIRC3/MALT1融合均与显著更差的无进展生存期（PFS）相关（图1J、图S5A）。多因素Cox回归进一步证实，这三个因素是独立的预后因子（图S5B、S5C）。其中LME2预后最差，可能与其高度的免疫激活导致的免疫耗竭及恶性B细胞持续增殖信号有关。

综上，Bulk RNA-seq通过整合大规模队列和微环境特征导向的聚类策略，首次建立了MALT淋巴瘤的LME三分类体系，为后续单细胞和空间层面的机制解析提供了清晰的分组框架。

二、snRNA-seq解析细胞异质性：从B细胞恶性程序到免疫亚群功能差异
2.1 FFPE样本的单细胞核测序技术突破
FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本是临床病理档案的主要形式，但传统单细胞测序对新鲜组织的要求限制了其在回顾性研究中的应用。本研究采用10x Genomics Flex平台，该平台通过探针杂交技术，能够对FFPE样本的细胞核进行转录组捕获。研究者从16例手术切除标本中制备了50μm厚的FFPE卷片，经核分离、DV200质控（>50%）、细胞核完整性评估（>80%）后，成功获得高质量snRNA-seq数据。经过CellBender去除背景噪音和严格质控（每个细胞核100–2500个基因、线粒体转录本<10%），最终保留96,778个细胞核。

数据经Harmony批次校正、PCA降维和Louvain聚类后，基于经典标记基因注释出六大主要细胞系：B细胞、T细胞、髓系细胞、基质细胞、肝细胞和肺泡细胞（图1E、图S2A）。进一步的亚聚类（subclustering）识别出更精细的细胞亚群，如CD8+ T细胞分为Teff、Temra和Tex，CD4+ T细胞分为Treg、Tfh和Tn，巨噬细胞分为SPARC、STAB1、MARCO和CHIT1等（图S2B–S2D）。

图1. MALT淋巴癌的LME亚型鉴定

2.2 恶性B细胞与正常B细胞的区分策略
由于MALT淋巴瘤中B细胞以恶性克隆为主，但FFPE样本中可能混杂正常组织来源的B细胞，准确区分两者至关重要。研究者采用了两条互补策略：一是使用inferCNV基于表达强度推断拷贝数变异（CNV），恶性B细胞通常表现出较大范围的染色体拷贝数改变；二是使用GSVA计算边缘区B细胞（MZB）特征评分（Mabbott & Gray, Immunology 2014），因为MALT淋巴瘤起源于MZB。结果显示，B_Mal（恶性B细胞）的CNV评分和MZB评分均显著高于B_Nor（正常B细胞）（图S3A–S3C）。此外，研究者还计算了每个细胞亚群的Shannon熵，以评估其在不同组织来源样本中的分布均匀性。5个低熵（<0.5）且>80%富集于肺或肝脏的亚群被判定为正常组织污染，从下游分析中剔除（图S4A）。这些质控步骤确保了后续分析聚焦于真正的肿瘤微环境。

2.3 恶性B细胞的转录元程序（MP）
为了解恶性B细胞内部的功能异质性，研究者对61,844个B_Mal细胞应用了NMF分解，每个样本独立运行秩4到9的NMF，共获得39个程序。通过比较不同秩之间以及不同样本之间程序基因的重叠度（≥70%程序内重叠，≥20%跨样本重叠），筛选出稳健的程序，再基于共享基因比例聚类，最终定义了7个元程序（MP），每个MP包含50个代表性基因（图2A、表S3）。功能注释显示：
- MP1（G1/S期） 和 MP3（G2/M期）：细胞周期相关，在LME3中富集（图2H）。单因素Cox回归显示两者均为不良预后因子（图2F）。
- MP2（未折叠蛋白反应）：与浆细胞分化相关。
- MP4（B细胞激活）：在LME2中最高（图2H），与BTK信号通路活性一致。
- MP5（核酸结合）：可能在转录调控中发挥作用。
- MP6（免疫球蛋白产生）：与浆细胞分化一致，且与MP3呈负相关，CytoTRACE2分析也显示MP6高表达的细胞分化程度更高（图2C、2D）。
- MP7（免疫调节）：包含CCL22和CCL17，已知可招募调节性T细胞（Treg）。MP7评分与CD4T_Treg细胞在CD4+ T细胞中的比例呈显著正相关（Pearson r = 0.78，图2G），提示恶性B细胞通过分泌趋化因子塑造免疫抑制微环境。

将B_Mal特征基因集应用于Bulk RNA-seq样本进行评分，并按中位数分组，高B_Mal评分组PFS显著更差（图2E）。值得注意的是，MP评分在不同LME亚型间差异显著，但在不同临床分期或年龄组间差异不显著（图S6B），说明LME分型比传统临床指标更能反映恶性B细胞的功能状态。

2.4 亚型特异性药物敏感预测
利用单细胞分辨率的数据，研究采用Beyondcell（基于药物反应基因特征）和scRANK（基于靶点扰动基因调控网络）两种独立算法预测药物敏感性。结果高度一致（图2I、图S7B）：
- LME1：对VEGFR抑制剂（索拉非尼、阿昔替尼、舒尼替尼）敏感，与其富含内皮细胞和血管生成通路一致。
- LME2：对BTK抑制剂（伊布替尼）敏感，与其高MP4（B细胞激活）一致。
- LME3：对微管靶向药物（长春新碱、长春瑞滨）敏感，与其高MP3（G2/M）一致。

免疫组化验证显示，LME1样本VEGFR2表达最高，LME2样本BTK表达最高，LME3样本Ki-67增殖指数最高（图S7C）。这些结果直接支持了LME分型指导精准治疗的潜力。

图2. 恶性B细胞的功能异质性与药物敏感性

2.5 T细胞、髓系细胞和基质细胞的精细图谱
snRNA-seq的优势在于能够解析稀有的免疫和基质亚群。研究对T细胞、髓系细胞、成纤维细胞和内皮细胞分别进行了深度亚聚类：
- CD8+ T细胞：LME2中耗竭表型（CD8T_Tex，表达HAVCR2、LAG3、PDCD1）比例显著高于LME1；而LME1中效应记忆T细胞（CD8T_Temra，表达GNLY、GZMB、PRF1）更富集（图3A、3D）。功能评分显示，LME2的CD8T_Tex具有最高的耗竭评分和最低的细胞毒性评分（图3C、3D）。
- 巨噬细胞：根据FOLR2和MRC1（CD206）的表达分为四个亚群。其中Mac_MARCO（FOLR2⁻MRC1⁺）在LME1中显著富集，具有最高的M2评分、血管生成评分和吞噬评分，是LME1中血管生成的关键驱动细胞（图3E–3I）。Mac_SPARC（FOLR2⁺MRC1⁺）在LME2中富集，偏向M1和Th1分化。
- 成纤维细胞：Fibro_CCL19（炎症相关）在LME2中富集，高表达抗原加工提呈和TNF-α/NF-κB通路；Fibro_LRRC15（肌成纤维细胞）在LME1中富集，高表达ECM相关基因（图3J–3O）。NicheNet分析进一步预测，TNF-α/NF-κB2信号驱动Fibro_CCL19，TGFB1/TGFB2驱动Fibro_LRRC15（图3L、3M）。
- 内皮细胞：分为静脉内皮（Endo_venous）、动脉内皮（Endo_arterial）和淋巴内皮（Endo_lymphatic）。LME1中动脉内皮血管生成评分更高，LME2中淋巴内皮淋巴细胞趋化评分更高（图S9E、S9G）。

这些结果表明，snRNA-seq不仅揭示了细胞组成的差异，更捕获了同一细胞亚群在不同LME中功能状态的转变。

图3. LME亚型中的免疫细胞和间质细胞异质性

三、细胞互作网络的定量分析：CellChat揭示亚型特异性信号流
细胞间的配体-受体相互作用强度也是微环境功能的核心。研究使用CellChat对snRNA-seq数据进行分析，分别计算了每种LME亚型中的通信概率。
- 总体通信强度：LME1和LME2显著高于LME3，后者因细胞稀疏而信号减弱（图4C）。
- 通路偏好：LME1中血管生成相关通路（VEGF、TGF-β、PDGF、胶原）占主导；LME2中淋巴细胞和B细胞激活相关通路（ICAM、CXCL、CD40、BAFF）占主导（图4D）。
- 关键细胞发送者/接收者：在LME2中，Mac_SPARC、FDC_CR2和Fibro_CCL19是信号的主要发送者，向T细胞和B细胞传递CD40、BAFF和CXCL信号（图4E–4G）。在LME1中，Neu_GOS2和Mac_MARCO是VEGF信号的主要发送者，作用于血管内皮（图4H–4I）。

特别值得注意的是，BAFF信号在LME2中主要由恶性B细胞自分泌，而CD40信号则主要来自其他细胞的旁分泌（图S10B–S10D）。这一发现提示，在炎症型微环境中，恶性B细胞不仅接受外源性支持，还通过自分泌BAFF实现一定程度的自主生长，与既往报道的HP感染非依赖性MALT淋巴瘤生长机制一致。

图4. 细胞模块及胞间通讯网络

四、空间转录组验证细胞互作网络：从共定位到信号距离
4.1 空间转录组实验设计与细胞类型映射
单细胞数据虽然提供了高分辨率的细胞异质性信息，但丢失了细胞在组织中的原始空间位置。为了在原位验证细胞互作关系，研究者选取了9例FFPE样本（每种LME亚型3例，包括胃和眼附属器等部位），进行10x Visium空间转录组测序。FFPE切片经H&E染色、探针杂交和CytAssist处理，测序后使用spaceranger进行定量。

为了将snRNA-seq定义的细胞亚群映射到空间转录组的每个spot（每个spot约含1–10个细胞），研究采用了cell2location贝叶斯模型。该模型利用snRNA-seq作为参考，估算每个spot中每种细胞类型的绝对丰度。7例空间样本有匹配的snRNA-seq数据（来自同一组织块），确保了映射的可靠性。

4.2 空间因子与细胞模块的共定位
基于cell2location的丰度估计，研究使用run_colocation函数提取了5个空间因子（SFs），每个SF代表一组经常共定位的细胞亚群（图5B）。结果显示：
- SF2和SF3：主要包含CM1模块的细胞（CD8T_Tex、CD4T_Treg、CD4T_Tfh、DC、Mac_SPARC、Fibro_CCL19、Endo_lymphatic、FDC_CR2），在LME2中贡献度更高（图5D）。
- SF5：主要包含CM2模块的细胞（血管内皮、Neu_GOS2、Mac_MARCO、周细胞），在LME1中贡献度更高（图5D）。
- SF4：富集于坏死或基质区域（图5C）。

这些空间因子与之前基于细胞比例相关性分析得到的细胞模块（CM1、CM2，图4A）高度一致，从空间上验证了这些细胞群的内聚性。

4.3 距离分析与配体动态
研究进一步计算了每个B_Mal阳性spot到其他细胞类型阳性spot的最短欧氏距离（若两个类型在同一spot内则距离为0）。结果显示，在LME2中，B_Mal与CD8T_Tex、CD4T_Tfh、FDC_CR2、Mac_SPARC的距离显著更近（图5G），支持LME2中免疫细胞与恶性B细胞的紧密空间接触。

更为重要的是，研究者分析了配体表达水平与细胞间距离的相关性。例如，对于每个spot，计算其到最近的CD4T_Tfh阳性spot的距离，然后与该spot的CD40LG表达做Spearman相关。在LME2中，CD40LG表达与距离呈显著负相关（即越靠近Tfh，CD40LG表达越高），而在LME1中无此趋势（图5H）。同样，在LME1中，VEGFA表达与到Neu_GOS2或Mac_MARCO的距离呈负相关（图5H）。这些定量分析首次在MALT淋巴瘤中证明了关键配体的表达具有空间梯度依赖性，为旁分泌信号网络提供了直接的空间证据。

4.4 多色免疫荧光（mIF）验证
为了在蛋白水平验证空间关系，研究者对15个样本（每种亚型5例）进行了多色免疫荧光染色（图5I）。结果显示：
- 在LME2中，PAX5⁺恶性B细胞与FOXP3⁺CD4⁺T细胞、PD1⁺CD8⁺T细胞的空间距离显著小于LME1（图5J）。
- 在LME1中，CD31⁺血管内皮细胞密度最高，且CD11b⁺CD15⁺中性粒细胞和CD206⁺MARCO⁺巨噬细胞更靠近内皮细胞（图5L）。VEGFA⁺的中性粒细胞和巨噬细胞比例在LME1中更高，且它们比VEGFA⁻的同类细胞更靠近内皮细胞（图S13E、S13F）。

这些独立验证结果与空间转录组的发现高度一致，增强了结论的可信度。
 

图5. 胞间互作的空间分布

结语
该研究通过Bulk RNA-seq、snRNA-seq和空间转录组的系统整合，首次绘制了跨组织MALT淋巴瘤的微环境异质性图谱，识别出三种具有不同细胞组成、信号网络和治疗敏感性的LME亚型。研究不仅揭示了恶性B细胞内在的转录程序异质性（7个MP），还解析了免疫与基质细胞在LME亚型间的功能可塑性，并通过空间转录组和mIF验证了关键配体-受体互作的空间梯度。这一工作为MALT淋巴瘤的精准分型和靶向治疗提供了坚实的分子基础，同时也为FFPE样本的回顾性多组学研究树立了一个高质量的技术示范。

Fig 8.Rac1介导COH实验性青光眼中RGC轴突退变的信号通路机制模式图

参考文献：
Kang K, Wu Y, Sun X, et al. Cross-tissue atlas of mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas reveals intratumoral heterogeneity and microenvironmental subtypes. Cell Rep Med. 2026;7(5):102785. doi:10.1016/j.xcrm.2026.102785

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