高通量微阵列芯片技术在菠萝果实软化关键基因功能研究中的应用
2026-06-15 来源:微信公众号 点击次数:58
我国菠萝产量年计156万吨，常温货架期仅7~10天，约20% 因成熟软化腐烂被废弃，储运损耗严重制约菠萝产业与外贸发展，亟需解析果实软化的分子机理、培育耐储运菠萝新品种。
果实软化的核心诱因是果肉细胞壁多糖（果胶为主）降解，内源水解酶是关键催化因子。已证实，在苹果、草莓、桃等水果中内源水解酶的多聚半乳糖醛酸酶 (PG)是主导细胞壁降解的关键酶，即PG基因家族主导果实软化，其余酶的活性极低，与细胞壁降解无显著关联。例如草莓 FaPG1/FaPG2、桃 PpPG21/PpPG22 沉默后果胶降解受阻、果实硬度提升。然而，菠萝的 PG 基因与果实的软化关系尚未确定。
文章题目为“Mutation of the Polygalacturonase Gene AcoPG3 Deferred Softening of Pineapple Fruit”于2025年4月发表在Biology杂志，作者来自于中国热带农业科学院，热带作物遗传资源研究所。
植物 PG 归属于糖苷水解酶 28 家族，分为外切 PG、内切 PG、鼠李半乳糖醛酸 PG；菠萝基因组共含有32个PG 家族基因，但仅4个（AcoPG1~AcoPG4）在成熟果肉中表达，前期无法区分功能主次。因此，明确菠萝果肉主导软化的主效 PG 基因，可为长货架期和菠萝育种提供基因资源与理论依据。
研究方法
试验材料：菠萝品种台农 17 号（海南儋州热科院试验田）；番茄品种京番 101；载体 pCAMBIA1300、SK-gRNA、pC1300Cas9；农杆菌 EHA105；抗体（LM18/LM19/JIM7/LM5/RU1/RU2 等，PlantProbes）。
（一）载体构建与遗传转化
AcoPG3 过表达载体构建：克隆 AcoPG3（GenBank：XM020243935）+ 上游 1.6 kb 启动子，连入 pMD-19T；GUS 标记基因插入 pCAMBIA1300，再将目的片段插入载体，获得过表达质粒 pC13GPRPG3；
CRISPR/Cas9 基因敲除AcoPG3载体：以 SK-gRNA、pC1300Cas9 为骨架构建 pC13Cas9PG3 编辑载体；
遗传转化：农杆菌 EHA105 介导侵染菠萝胚性愈伤与番茄愈伤，潮霉素（20 μg/L）筛选阳性苗，PCR/GUS 染色鉴定转基因株系；筛选过表达株 APG3-2、基因编辑突变株 MPG3-1、空载对照 EV用于后续生理测定。
（二）生理指标测定（详情见原文）
果实硬度、PG 酶活、细胞壁分离、胞间液（质外体液）含量、电解质渗漏率测定。
（三）植物细胞壁多糖组分分析，使用英国ArrayJet微阵列生物芯片点样仪点印多糖碳水化合物芯片（COMPP）
样品准备：细胞壁沉淀经水相、Na₂CO₃、KOH、Cadoxen四种缓冲液分步分级萃取，各萃取液稀释 4 倍。
多糖芯片制备和检测：使用ArrayJet非接触式微阵列生物芯片点样仪将样品喷点在尼龙膜上制备多糖芯片，随后使用一抗（JIM7/LM18/LM19/LM5/RU1/RU2 等特异性果胶单抗）孵育多糖芯片，羊抗兔 IgG 二抗显色，CanoScan 8800F 扫描成像，ImaGene 6.0 软件对多糖芯片进行定量分析，区分甲酯化果胶、非甲酯同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I （RG-I）主链、半乳聚糖、木葡聚糖等组分的含量变化。
多糖芯片结果表明：APG3-2（AcoPG3 过表达），甲酯化果胶、非甲酯 HG 、RG-I 骨架、半乳聚糖含量显著下降；MPG3-1（基因敲除突变体）上述果胶组分显著升高；木葡聚糖、甘露聚糖在所有株系无显著差异。AcoPG3 只专一降解果胶大类（甲酯化果胶、HG、RG-I），不参与木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖降解（图1）。
研究结论
01 AcoPG3 是菠萝果实软化的主效基因
在4个菠萝果肉表达PG基因中，AcoPG1、AcoPG2 无 PG 催化活性，AcoPG4 酶活仅为AcoPG3的 1/4.6，AcoPG3是调控菠萝果肉PG总酶活的决定性基因。
• 番茄异源过表达株AcoPG3：转基因番茄果实比空载对照提前 9 d 软化；
• 菠萝过表达株 APG3-2：采收当日即启动软化，PG 酶活全时期显著高于野生型 (WT)；
• CRISPR敲除 AcoPG3突变株 MPG3-1：采收后37 d 才开始软化（WT 第 6 d 软化，较对照延后 31 d），常温贮藏 30 d 硬度仍接近采收当天野生型水平。
02 AcoPG3 通过调控 PG 酶活可改变细胞壁果胶降解
• PG 酶活排序：APG3-2＞野生型＞MPG3-1；
• 果肉细胞壁中甲酯化果胶、非甲酯同型半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖- I，三者含量排序一致：MPG3-1＞野生型＞APG3-2，木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖在各株系无显著差异。
因此，敲除 AcoPG3 可降低菠萝果肉 PG 活性，抑制甲酯化果胶、HG、RG-I、半乳聚糖降解，维持细胞壁完整，延缓果实软化、显著延长货架期；AcoPG3 是菠萝耐储运育种关键靶标基因。同时，多糖碳水化合物芯片技术，可精准匹配热带水果细胞壁多糖组分高通量解析，为芒果、榴莲等其他热带果品软化机理研究提供成熟技术范式。
原文链接：https://doi.org/10.3390/biology14050474
英国ArrayJet高通量微阵列生物芯片点样仪
ArrayJet位于英国爱丁堡，专注于提供微阵列生物芯片、高通量筛选等应用领域的解决方案及服务，致力于开发快速高通量液体处理平台，目前用户遍布全球。
制备高密度的微阵列生物芯片，用于小分子化合物/蛋白质/多肽/核酸/多糖超高通量筛选
速度快：点样速度711个样片点／秒
通量高：单次进行18432种不同样品的快速点样，具备128个平行喷点通道
精度高： CV<5%（可实现精准的点上点样，实现微型的点对点ELISA反应）
完整的环境控制模块以及防样品蒸发保护（大幅降低点样过程中样品浓度变化）
应用方向：
基因芯片：高通量分子互作验证、疾病功能基因检测或筛选等
蛋白质芯片：高通量功能蛋白质筛选、抗原表位筛选、生物靶点筛选等
多糖芯片：进行高通量糖功能学、糖蛋白、植物凝集素等研究等
小分子化合物芯片：高通量药物筛选、疾病研究、疾病标志物筛选等
镀金SRPi芯片：高通量分子互作研究等
微孔板芯片：高通量多重因子检测、微型ELISA等
微流控芯片、生物传感器芯片：药物研发、体外诊断、生物半导体研发等
临床快检POCT芯片：抗原抗体检测、过敏原检测、病原微生物检测等
果实软化的核心诱因是果肉细胞壁多糖（果胶为主）降解，内源水解酶是关键催化因子。已证实，在苹果、草莓、桃等水果中内源水解酶的多聚半乳糖醛酸酶 (PG)是主导细胞壁降解的关键酶，即PG基因家族主导果实软化，其余酶的活性极低，与细胞壁降解无显著关联。例如草莓 FaPG1/FaPG2、桃 PpPG21/PpPG22 沉默后果胶降解受阻、果实硬度提升。然而，菠萝的 PG 基因与果实的软化关系尚未确定。
文章题目为“Mutation of the Polygalacturonase Gene AcoPG3 Deferred Softening of Pineapple Fruit”于2025年4月发表在Biology杂志，作者来自于中国热带农业科学院，热带作物遗传资源研究所。
植物 PG 归属于糖苷水解酶 28 家族，分为外切 PG、内切 PG、鼠李半乳糖醛酸 PG；菠萝基因组共含有32个PG 家族基因，但仅4个（AcoPG1~AcoPG4）在成熟果肉中表达，前期无法区分功能主次。因此，明确菠萝果肉主导软化的主效 PG 基因，可为长货架期和菠萝育种提供基因资源与理论依据。
研究方法
试验材料：菠萝品种台农 17 号（海南儋州热科院试验田）；番茄品种京番 101；载体 pCAMBIA1300、SK-gRNA、pC1300Cas9；农杆菌 EHA105；抗体（LM18/LM19/JIM7/LM5/RU1/RU2 等，PlantProbes）。
（一）载体构建与遗传转化
AcoPG3 过表达载体构建：克隆 AcoPG3（GenBank：XM020243935）+ 上游 1.6 kb 启动子，连入 pMD-19T；GUS 标记基因插入 pCAMBIA1300，再将目的片段插入载体，获得过表达质粒 pC13GPRPG3；
CRISPR/Cas9 基因敲除AcoPG3载体：以 SK-gRNA、pC1300Cas9 为骨架构建 pC13Cas9PG3 编辑载体；
遗传转化：农杆菌 EHA105 介导侵染菠萝胚性愈伤与番茄愈伤，潮霉素（20 μg/L）筛选阳性苗，PCR/GUS 染色鉴定转基因株系；筛选过表达株 APG3-2、基因编辑突变株 MPG3-1、空载对照 EV用于后续生理测定。
（二）生理指标测定（详情见原文）
果实硬度、PG 酶活、细胞壁分离、胞间液（质外体液）含量、电解质渗漏率测定。
（三）植物细胞壁多糖组分分析，使用英国ArrayJet微阵列生物芯片点样仪点印多糖碳水化合物芯片（COMPP）
样品准备：细胞壁沉淀经水相、Na₂CO₃、KOH、Cadoxen四种缓冲液分步分级萃取，各萃取液稀释 4 倍。
多糖芯片制备和检测：使用ArrayJet非接触式微阵列生物芯片点样仪将样品喷点在尼龙膜上制备多糖芯片，随后使用一抗（JIM7/LM18/LM19/LM5/RU1/RU2 等特异性果胶单抗）孵育多糖芯片，羊抗兔 IgG 二抗显色，CanoScan 8800F 扫描成像，ImaGene 6.0 软件对多糖芯片进行定量分析，区分甲酯化果胶、非甲酯同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、鼠李半乳糖醛酸聚糖I （RG-I）主链、半乳聚糖、木葡聚糖等组分的含量变化。
多糖芯片结果表明：APG3-2（AcoPG3 过表达），甲酯化果胶、非甲酯 HG 、RG-I 骨架、半乳聚糖含量显著下降；MPG3-1（基因敲除突变体）上述果胶组分显著升高；木葡聚糖、甘露聚糖在所有株系无显著差异。AcoPG3 只专一降解果胶大类（甲酯化果胶、HG、RG-I），不参与木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖降解（图1）。
图1: 多糖碳水化合物芯片 （CoMPP）结果分析：JIM7识别甲酯化同型半乳糖醛酸 HG（甲酯化果胶）；LM18/LM19识别非甲酯化 HG；LM5：RG-I 识别侧链半乳聚糖；RU1/RU2识别RG-I 主链；LM15/LM25识别木葡聚糖、木聚糖（WT：野生型；EV-1 EV-2：阴性对照组；APG3-2：过表达组；MPG3-1：基因敲除组）
研究结论
01 AcoPG3 是菠萝果实软化的主效基因
在4个菠萝果肉表达PG基因中，AcoPG1、AcoPG2 无 PG 催化活性，AcoPG4 酶活仅为AcoPG3的 1/4.6，AcoPG3是调控菠萝果肉PG总酶活的决定性基因。
• 番茄异源过表达株AcoPG3：转基因番茄果实比空载对照提前 9 d 软化；
• 菠萝过表达株 APG3-2：采收当日即启动软化，PG 酶活全时期显著高于野生型 (WT)；
• CRISPR敲除 AcoPG3突变株 MPG3-1：采收后37 d 才开始软化（WT 第 6 d 软化，较对照延后 31 d），常温贮藏 30 d 硬度仍接近采收当天野生型水平。
02 AcoPG3 通过调控 PG 酶活可改变细胞壁果胶降解
• PG 酶活排序：APG3-2＞野生型＞MPG3-1；
• 果肉细胞壁中甲酯化果胶、非甲酯同型半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖- I，三者含量排序一致：MPG3-1＞野生型＞APG3-2，木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖在各株系无显著差异。
因此，敲除 AcoPG3 可降低菠萝果肉 PG 活性，抑制甲酯化果胶、HG、RG-I、半乳聚糖降解，维持细胞壁完整，延缓果实软化、显著延长货架期；AcoPG3 是菠萝耐储运育种关键靶标基因。同时，多糖碳水化合物芯片技术，可精准匹配热带水果细胞壁多糖组分高通量解析，为芒果、榴莲等其他热带果品软化机理研究提供成熟技术范式。
原文链接：https://doi.org/10.3390/biology14050474
英国ArrayJet高通量微阵列生物芯片点样仪
ArrayJet位于英国爱丁堡，专注于提供微阵列生物芯片、高通量筛选等应用领域的解决方案及服务，致力于开发快速高通量液体处理平台，目前用户遍布全球。
制备高密度的微阵列生物芯片，用于小分子化合物/蛋白质/多肽/核酸/多糖超高通量筛选
速度快：点样速度711个样片点／秒
通量高：单次进行18432种不同样品的快速点样，具备128个平行喷点通道
精度高： CV<5%（可实现精准的点上点样，实现微型的点对点ELISA反应）
完整的环境控制模块以及防样品蒸发保护（大幅降低点样过程中样品浓度变化）
应用方向：
基因芯片：高通量分子互作验证、疾病功能基因检测或筛选等
蛋白质芯片：高通量功能蛋白质筛选、抗原表位筛选、生物靶点筛选等
多糖芯片：进行高通量糖功能学、糖蛋白、植物凝集素等研究等
小分子化合物芯片：高通量药物筛选、疾病研究、疾病标志物筛选等
镀金SRPi芯片：高通量分子互作研究等
微孔板芯片：高通量多重因子检测、微型ELISA等
微流控芯片、生物传感器芯片：药物研发、体外诊断、生物半导体研发等
临床快检POCT芯片：抗原抗体检测、过敏原检测、病原微生物检测等
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