说起绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP），各位科研工作者一定不陌生。GFP是一种具有自发荧光的蛋白质，已被广泛应用于生物学研究、成像、分子生物学及生物医学等多个领域。关于GFP的历史，可以追溯到1962年。

本期，小编就从GFP的发现、结构、变体和应用几个角度，为大家梳理这个"明星工具蛋白"的前世今生。

1. GFP的发现
GFP最初来源于海葵（Aequorea victoria）的组织，1988年由Osamu Shimomura研究团队发现并鉴定，随后由Martin Chalfie和Roger Y. Tsien等科学家对其进行了深入研究。

图1. 海葵（Aequorea Victoria）

但GFP真正的"科研之路"开启于1994年2月11日出版的《Science》杂志。这一期封面展示了秀丽隐杆线虫的绿色发光感觉神经元，一经发表即被认为是细胞生物学的一个重大突破。

图2. Science杂志封面展示GFP修饰的秀丽隐杆线虫

从此，GFP及其他后续发现的荧光蛋白，作为当代生物科学中至关重要的工具之一，已辅助科学家发展出多种方法来观察曾经"不可见"的过程。

2. GFP的结构
GFP是一种直径约为3.2纳米的蛋白质，由238个氨基酸残基组成。荧光的产生依赖于GFP蛋白质内部三个氨基酸残基（丝氨酸、天冬氨酸和酪氨酸）形成的花环结构。

光谱特性：
· 激发光谱
在395nm附近（紫外）有一个主激发峰，在470nm附近（蓝光）有一个次激发峰。

· 发射光谱
在509nm附近（绿光）有发射峰，在540nm附近有侧峰。

· 实际使用波段
虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害更小，通常多使用该波段光源（多为488nm）。

当紫外光（395-470nm）照射到GFP分子上时，花环结构通过共轭共振的方式将紫外光能量转化为绿色荧光。

图3. GFP的晶体结构

3. GFP的变体
虽然GFP应用广泛，但仍存在一些局限，例如较低的亮度、荧光强度等。为了更好地进行研究，科学家们陆续研发出多种GFP变体。这些变种荧光蛋白的荧光颜色、发射波长和荧光强度不同，可应用于多光子显微镜、荧光共振能量转移（FRET）和荧光激活细胞分选（FACS）等技术中，进一步拓展了GFP在生物学研究中的应用范围。

EGFP（增强型绿色荧光蛋白）
应用广泛的红移变体是1994年被发现的GFP单点突变体：GFP-S65T，其第65位由Ser突变为Thr。

相比野生型GFP的改进：
· 发光强度和光稳定性更好
· 激发峰简化

野生型GFP在395nm和475nm有两个主要激发峰，而GFP-S65T仅有一个484nm的激发峰。
· 发射波长保持在509nm
光谱特性几乎符合经典的FITC荧光特性（FITCex：496nm，FITCem：520-530nm）。
这种GFP突变体因荧光比野生型GFP亮很多倍，被称为增强型GFP，即EGFP。

图4. EGFP的应用

dEGFP（不稳定增强型绿色荧光蛋白）
野生型GFP和EGFP以及其他多数突变体的半衰期较长，不适用于需要精确追踪表达减少和损耗的研究。1998年，科学家构建了另一种突变体：不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。

构建原理： 小鼠的鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）包含一个PEST序列，该序列有促进蛋白在细胞中降解的功能。dEGFP就是将EGFP的cDNA序列融合到ODC基因的C-末端，使其可以被PEST降解，有利于实时追踪基因表达动力学的研究。

多彩荧光变体
在很多研究中，只有一种荧光颜色不能满足研究需求，科学家们还研究了不同颜色的荧光蛋白。

· 黄色突变体——EYFP
使GFP的四个氨基酸发生突变后，EYFP的发射光变成黄绿色，荧光亮度与EGFP相似。应用广泛的黄色荧光蛋白mCitrine和mVenus就是在EYFP基础上改进的突变体。

· 蓝色突变体——EBFP
使GFP的四个氨基酸发生突变后，EBFP的激发波长为380nm，发射波长为440nm。由于EBFP发光较为微弱，针对其研发出了3个更亮的荧光突变体：Azurite、EBFP2和mTagBFP。

· 青色突变体——ECFP
使GFP六个氨基酸发生突变后，ECFP的激发波长有433nm和453nm主次两个激发峰，发射波长在475nm和510nm两峰。

图5. 不同海葵个体及其中纯化的荧光蛋白

4. GFP的应用
GFP化学性质稳定，可以耐受高温、强酸和强碱等极端条件下的处理，适用于多种实验条件。GFP的荧光信号可以直接在活细胞或活体中观察，无光漂白现象，荧光性质不会被甲醛固定、石蜡包埋所影响。

主要应用方向：
· 基因表达与蛋白质定位
通过将GFP融合到目标蛋白的编码基因上，可以实现对该蛋白表达和定位的实时监测。

· 蛋白质相互作用研究
通过改变GFP分子的结构和染色体位置，可以实现对蛋白质相互作用、结构和功能的研究。

· 细胞追踪和标记
将GFP标记到特定细胞或组织中，观察其在发育、疾病和治疗过程中的动态变化。

· 疾病模型研究

图6. EGFP在小鼠不同组织中的表达（南模生物自研R26-CAG-EGFP，目录号NM-KI-190090）

南模生物荧光蛋白工具鼠
南模生物自主研发多种荧光蛋白工具鼠，即在目的基因的特定位置引入报告基因（包括荧光蛋白，如EGFP、mYFP等）或标记基因的小鼠模型。与特定重组酶工具鼠杂交，可以实现在特定细胞类群标记出所需荧光，帮助蛋白标记、谱系示踪等实验顺利进行。

图7. 部分荧光蛋白工具鼠

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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。

参考文献
[1] Ssblakely, via Wikimedia Commons.
[2] Remington S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein science. 2011. 20(9), 1509–1519.
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[4] Elliott KL, Kersigo J, Lee JH, et al. Developmental Changes in Peripherin-eGFP Expression in Spiral Ganglion Neurons. Front Cell Neurosci. 2021. 15:678113.
[5] Lambert GG, Depernet H, Gotthard G, et al. Aequorea's secrets revealed: New fluorescent proteins with unique properties for bioimaging and biosensing. PLoS Biol. 2020. 18(11):e3000936.