细胞瞬时表达常用方法与应用及瞬时转染操作步骤详细介绍
2026-07-10 来源:本站 点击次数:15什么是瞬时转染？
将外源核酸（如质粒DNA、mRNA等）导入真核细胞后，外源核酸不整合到宿主细胞的基因组中，仅在细胞内短暂表达的过程。(通常 24–96 小时）高水平表达，随后随着细胞分裂被稀释或降解，表达逐渐减弱直至消失。
瞬时表达常用的方法：
脂质体转染（如 Lipofectamine 系列）
磷酸钙共沉淀法
电穿孔
病毒载体介导（如腺病毒，非整合型）
瞬时表达主要用于：
基因功能快速验证
蛋白过表达与检测
启动子活性分析
RNA干扰（siRNA/shRNA）实验
报告基因实验（如荧光素酶）
1.细胞培养
细胞状态：处于对数生长期，汇合度 70–90%
细胞准备：建议使用低代次细胞（<20 代），感染前先检测支原体污染，若无污染，便可以实验，若有支原体污染需要先清除支原体后再脱支原体试剂培养两代感染效果最好
培养基：转染前 2–4 小时换液为无抗生素完全培养基（抗生素会降低转染效率）
2.质粒准备
质粒纯度：A260/A280 = 1.8–2.0，无内毒素（Endotoxin-free）
浓度：建议 0.5–5 μg/μL，溶于无菌水或 TE 缓冲液
3.试剂准备
转染试剂（如 Lipofectamine 3000、PEI、FuGENE 等）
Opti-MEM 或无血清培养基（用于稀释）
转染操作步骤（以 6 孔板为例）
| 步骤 | 操作内容 |
| 1.铺板 | 转染前取18–24 h接种细胞，确保转染时汇合度在70%以上。 |
| 2.稀释质粒 | 取 2.5 μg 质粒 DNA，用 125 μL Opti-MEM 稀释，混匀 |
| 3.稀释试剂 | 取 3.75 μL Lipofectamine 3000，用 125 μL Opti-MEM 稀释；另取 125 μL Opti-MEM + 2.5 μL P3000 稀释，放置准备使用 |
| 4.混合 | 将稀释好的质粒与转染试剂等体积混合，室温静置 10–15 min（形成 DNA-脂质体复合物） |
| 5.加样 | 将 250 μL 复合物逐滴加入细胞中，轻轻晃动混匀 |
| 6.培养 | 37°C、5% CO₂ 培养箱中继续培养 |
| 7.换液 | 4–6 h 后更换为完全培养基 |
不同孔板瞬转细胞的参考用量（以Lipofectamine 3000为例）
| 培养器皿 | 细胞数 | DNA (μg) | 试剂 (μL) |
| 96 孔板 | 1–2×10⁴ | 0.1 | 0.15 |
| 24 孔板 | 1–2×10⁵ | 0.5 | 0.75 |
| 6 孔板 | 2–4×10⁵ | 2.5 | 3.75 |
| 10 cm 皿 | 1–2×10⁶ | 7.5 | 11.25 |
注意细节，转染一步到位：
· 细胞密度是关键：过密（>95%）会导致转染效率下降；过稀则影响细胞状态
· 无抗生素：转染过程中避免使用双抗，减少细胞毒性
· 质粒质量：内毒素会显著降低转染效率并引起细胞死亡
· 血清影响：部分试剂兼容血清，但大多数脂质体法建议用无血清培养基稀释
· 复合物静置时间：不宜超过 20 min，否则复合物会聚集沉淀
· 毒性控制：若细胞死亡严重，可减少试剂用量或缩短换液时间。
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