双视角贝塞尔双光子成像 开启高速三维神经活动观测
2026-07-10 来源:本站 点击次数:59神经元对突触输入的时空整合是神经计算的核心过程，相关树突事件发生在毫秒级时间尺度与亚微米级空间尺度，传统双光子显微成像的采集速度瓶颈，难以完整捕捉快速三维神经动态。本研究开发了双视角贝塞尔双光子投影显微技术（dv-B2PM），实现100 Hz全体积采集的突触级分辨率高速体成像，通过同步采集同一三维体积的两个正交投影保留空间信息；结合双光子谷氨酸解笼锁技术，成功可视化局部刺激后神经元内的三维钙动态，揭示了树突整合过程中多尺度钙信号的传播规律。
本研究由 Dongli Xu、Fuu-Jiun Hwang、Jun B. Ding 与 Leilei Peng 共同完成，论文题为《Two-photon 3D imaging of optically stimulated neural activity at 100 Hz》，于 2026 年发表于《Light: Science & Applications》。
重要发现
01dv-B2PM 系统的光学设计与成像参数
dv-B2PM 基于双光子贝塞尔光片显微镜架构改造，采用两个呈 90 度夹角的物镜搭建正置成像系统，核心创新在于双视角投影采集模式。系统利用贝塞尔光束对成像体积进行光栅扫描，形成延展且薄的双光子光片，支持大视场下的高分辨率三维成像。与传统逐层扫描的光片成像不同，双视角模式下，系统分别通过光电倍增管与相机同步采集同一三维体积的两个正交投影图像，将体信息压缩至单次曝光中获取，消除了机械调焦与相机读出带来的时间延迟；同时两个正交视角保留了完整的三维空间信息，可对树突信号进行精准三维定位。
具有2P开孔的双视贝塞尔2P投影显微镜（dv-B2PM）示意图
该技术可在 120×80×42 μm³ 的视场范围内实现 100 体积每秒的成像速度，光学体素分辨率达 0.5×0.5×0.75 μm³，数字体素采样尺寸为 0.3×0.3×0.3 μm³，能够以高时空保真度直接观测树突整合与平台电位传播过程。在此基础上，系统整合了独立控制的双光子谷氨酸解笼锁光路，可对目标位点进行精准的光遗传刺激，刺激位置可通过二维扫描器独立横向定位，配合电调透镜实现轴向聚焦调控，从而在高速成像的同时完成定点突触刺激。
02光刺激下神经元钙响应的分级模式研究以 GCaMP8m 标记的小鼠运动皮层 5/6 层脑片为实验对象，在树突棘附近施加双光子谷氨酸解笼锁刺激，通过 dv-B2PM 同步记录全神经元的钙活动变化。实验观测到两种截然不同的钙活动模式：阈下刺激条件下，钙信号仅局限在刺激位点周围的短树突段内，对应钙瞬变呈现单一快速峰形；阈上刺激条件下，钙信号会扩散至胞体与更多树突分支，信号在初始峰后常出现缓慢上升的二次上升相，衰减过程显著延长，部分刺激位点还会产生长时程的平台型钙信号。
双视角贝塞尔2P投影成像下2P谷氨酸解光诱发的钙反应
为验证两种模式的转换规律，研究在同一神经元的顶端树突远端施加不同功率的解笼锁刺激，保持刺激时长与占空比不变。结果显示，低功率刺激下，钙信号局限在刺激位点与胞体之间的树突段，信号幅度向胞体方向逐渐衰减，无法有效传至胞体；高功率刺激下，强钙信号覆盖神经元所有主要树突结构与胞体，可完整重构神经元的三维形态。得益于双正交视角的设计，即使是垂直于单一投影平面的树突段，也能被清晰识别与定量分析，避免了单视角投影成像中结构遮挡导致的信号丢失。
03多尺度钙信号的时空传播机制研究通过长时程与短时程两类分析方法，系统解析了钙信号的时空动力学特征。长时程分析采用指数修正高斯峰构成的多峰模型对钙信号进行拟合，结果显示，阈上刺激下的钙信号包含两个时间尺度的成分：早期峰起源于刺激位点，沿树突向胞体与远端双向传播，向胞体的传播速度约为24 μm/s，向树突远端的传播速度约为 77 μm/s；晚期峰最早出现在胞体位置，随后向刺激位点方向反向传播，平均传播速度约 25 μm/s，该成分与胞体产生的反向传播动作电位所诱导的钙信号特征一致。
单点光解笼刺激增强条件下神经元内钙信号的时空活动
短时程分析采用二维连续小波变换，从信号中分离出5-40 Hz 的快速钙瞬变成分。这些快速瞬变均起源于解笼锁刺激位点，沿树突双向传播，传播速度跨度极大，从数十微米每秒到毫米每秒级别。其中高频段的瞬变信号传播速度超出当前测量范围，推测对应电压门控通道介导的快速钙信号；5-10 Hz 频段的长程瞬变可在刺激后立即以约 1.5 mm/s 的速度向胞体传播，实现快速的长距离信号传递；多数 5-20 Hz 的区域型瞬变从刺激位点出发，以数十至数百微米每秒的速度传播，并终止于树突上的钙信号热点，在热点处形成持续的局部钙瞬变。所有快速钙波动均由突触刺激触发，即使在阈上刺激条件下，也未观测到胞体起源的快速瞬变信号。
沿信号通路的钙信号短时间尺度时空分析
创新与亮点
该研究突破了传统双光子成像“速度-分辨率-成像体积” 的权衡瓶颈：传统点扫描双光子体成像帧率低，难以捕捉毫秒级神经动态；单视角投影成像丢失深度信息，结构重叠易产生歧义；小角度立体投影的深度分辨率不足，无法达到突触级成像精度。dv-B2PM通过正交双视角投影方案，在100体积每秒的体成像速度下维持突触级分辨率，等效成像性能对应14 kHz帧速的传统扫描双光子系统，同时具备更低的噪声水平与更强的弱信号检测能力。
在应用价值层面，该技术首次实现了突触级分辨率的百赫兹三维神经元钙动态观测，可完整追踪树突整合过程中钙信号的三维传播路径，为解析树突计算、突触整合的生物物理机制提供了全光学研究平台，也可拓展至其他快速细胞过程的三维成像研究。
总结与展望
dv-B2PM 技术通过双正交投影的创新设计，实现了高时空分辨率的高速三维神经成像，结合光刺激技术完整揭示了神经元树突整合过程中多尺度钙信号的时空传播规律，填补了光学成像与神经元整合动态生物物理研究之间的技术缺口。未来该技术可结合基因编码电压指示剂实现电压动态的直接观测，也可拓展至神经环路水平的多细胞活动成像，为解析大脑计算机制提供更有力的技术支撑。
声明：本文仅用作学术目的。
Xu, D., Hwang, FJ., Ding, J.B. et al. Two-photon 3D imaging of optically stimulated neural activity at 100 Hz. Light Sci Appl 15, 303 (2026).
doi: https://doi.org/10.1038/s41377-026-02395-2