利用 Cre-loxP 系统构建条件性基因敲除小鼠时，在非目标组织中检测到 Cre 活性是研究者常见的困扰。漏表达并不等同于模型不可用——许多被领域公认的 Cre 转基因小鼠品系本身也存在不同程度的泄漏。关键在于通过严谨的小鼠基因型鉴定，正确区分神经类 Cre 的生殖系泄漏与血管类 Cre 的发育痕迹信号，评估其对实验的实际影响，并选择合理的应对方案（包括诱导型 CreER 系统作为替代）。

01 神经类 Cre 鼠生殖泄漏
泄漏机制
在神经科学研究中，常用的 Cre 品系如 Nestin-Cre、Emx1-Cre 或 Camk2a-Cre 通常被认为具有较高的神经元特异性 [1]。然而，多项研究证实，神经类 Cre 转基因小鼠和 flox 鼠交配，可能出现大量生殖泄漏的情况——当 Cre 在生殖细胞（精子或卵子）中发生泄漏表达时，会导致 flox 区域在配子形成过程中即被删除，从而直接传递给后代。

因此，原本预期基因型为"Cre 阴性；flox 阳性"的对照组小鼠，实际上其全身所有细胞可能都已经是"杂合或纯合敲除"型了，因为它们从受精卵开始就继承了已被删除的等位基因。但因为这些品系的核心驱动效率足够强，在目标细胞群中能实现高效、特异的基因重组，所以仍然被广泛认可和使用。

如何应对
遇到生殖泄漏严重的 Cre 鼠，与 flox 小鼠交配后，应对子代尽早进行严格的双基因型鉴定，包括 Cre 与 flox 基因型，尤其需确认 flox 是否成功敲入以及是否存在 KO 条带。

· 若子代出现"Cre 阴性，flox 阴性，KO 阳性"的基因型，说明亲本 Cre 鼠已经出现严重的生殖泄漏，需及时剔除这类亲本和子代小鼠。

· 同时也要剔除"Cre 阳性，flox 阴性，有 KO 条带"的子代鼠，避免生殖泄漏范围进一步扩大。

通过对后代进行严格的小鼠基因型鉴定，以确保条件性基因敲除小鼠的敲除是组织特异性的而非全身性的。

02 血管类 Cre 泄漏：基因型检测的陷阱
为什么几乎所有组织都能检出重组信号
常用的血管内皮细胞 Cre 品系，如 Tie2-Cre 和 Cdh5-Cre，都有一个特点 [2]：在通过鼠尾或脚趾样本进行小鼠基因型鉴定时，你很可能在几乎所有组织（包括血液细胞）的 DNA 样本中都能检测到 Cre 介导的重组信号，即 flox+KO 嵌合；Cre 阳性的基因型。

其原因是这些基因的启动子在胚胎发育早期（如在造血干细胞中）就有短暂但广泛的活性。这些早期表达 Cre 的细胞及其后代（包括各类血细胞）会永久地携带重组的基因，因此从这些细胞中提取的 DNA 会永远呈现阳性信号。这通常不影响体内实验，因为在成年转基因小鼠体内，这些 Cre 的表达通常会被限制在血管内皮细胞中，具有很高的特异性。

如何应对
基因型 PCR 检测只能说明"DNA 是否被重组过"，而不能反映"Cre 当前是否表达"。阳性信号仅代表动物体内存在一些发生过重组的细胞，并不代表你的目标组织（如心脏、大脑的血管）已实现特异性敲除。

如担心 Cre 有漏表达现象，可先通过基因型鉴定筛选出"flox+KO 嵌合；Cre 阳性"的基因型个体。再通过免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）在组织切片水平直接观察你的目标基因蛋白是否在血管内皮细胞中被成功敲除，并在其他细胞类型（如周围的平滑肌细胞、神经元、血细胞）中是否仍正常表达 [3]。这是证明其体内特异性的最直接证据。

血管类 Cre 小鼠的泄漏信号是其发育过程的痕迹，并不代表成年期特异性缺失。 只要通过组织学验证其在目标内皮细胞中的特异性，该类基因敲除小鼠品系仍可正常使用。

替代方案：诱导型 CreER 鼠

如果遇到构建好的 Cre 鼠出现严重生殖泄漏，完全筛选不出特异性的后代，此时可优先选择用诱导型 CreER 鼠代替 Cre 鼠。该转基因小鼠只有在给予他莫昔芬（Tamoxifen）后，CreER 才会进入细胞核发挥作用，这可以极大地控制重组发生的时间，并有效避免发育早期或生殖系中的泄漏表达。
 

图. Tamoxifen 诱导的 Cre-ER 系统原理 [4]

往期推文：
小鼠大学问 | Cre-Lox 系统核心原理全解析
小鼠大学问 | Cre-lox 系统的常见问题汇总
没有完美的 Cre，几乎所有 Cre 品系都存在某种程度的泄漏，这是由启动子特性、插入位点、表观遗传等多种因素决定的。遇到 Cre 漏表达，首先要做的是科学的诊断，而不是恐慌性的废弃。理解泄漏的性质，设计合理的鉴定和筛选方法，你的基因敲除小鼠实验依然可以产出可信的数据。

参考文献：
[1] Madison, L., et al. (2015). A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience, 18(6), 793–802.

[2] Alva, J. A., et al. (2006). VE-Cadherin-Cre-recombinase transgenic mouse: a tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Developmental Dynamics, 235(3), 759–767.

[3] Tang, S., et al. (2010). A Cre recombination-based reporter system for mapping and manipulating neural circuits. Nature Protocols, 5(6), 1086–1100.

[4] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147.

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