胰腺囊性肿瘤（PCN）是胰腺癌的癌前病变，60岁以上人群患病率超40%，已成为全球性疾病负担。PCN涵盖从良性到恶性的多种病变类型。当前临床及影像学风险分层准确性不足，导致大量良性患者接受不必要的手术，而恶性PCN又常被延误识别。囊液是评估肿瘤生物学特征的理想样本，但现有研究多集中于基因组变异，糖蛋白标志物的探索尚处起步阶段。糖基化异常已被公认为癌症特征之一，质谱技术的发展使得糖基化位点与糖型的高通量分析成为可能，为筛选肿瘤特异性糖蛋白标志物提供了技术支撑。

文献解析
研究成果展示      
▶ 发表时间：2023年10月18日
▶ 期刊： Transduction and Targeted Therapy （IF 52.7）
▶ 文章标题：
Cyst fluid glycoproteins accurately distinguishing malignancies of pancreatic cystic neoplasm
▶ 核心内容：

近日，北京协和医院团队联合国内多中心，用基于质谱的糖蛋白组学技术，结合平行反应监测（PRM）靶向验证，在胰腺囊性肿瘤（PCN）中筛选并验证了一组可精准区分良恶性病变的新型N-糖蛋白标志物。该研究首次证实，糖蛋白质组学在鉴别恶性PCN方面显著优于常规蛋白质组，其中PHKB、CEACAM5、ATP6V0A4的特定糖基化形式展现出优异的诊断效能（AUC最高达0.948），为解决PCN临床诊疗中“过度手术”与“漏诊恶性”的双重困境提供了关键证据。

研究方法
本研究采用质谱（MS）基础的糖蛋白组学与蛋白质组学联合分析策略，分发现队列和验证队列两个阶段开展，发现阶段纳入低级别IPMN、侵袭性IPMN、SCN患者的囊液样本（n=16），对囊液蛋白进行胰酶酶解，分为两组：一组经ZIC-HILIC富集N-糖肽开展糖蛋白质组学LC-MS/MS分析，另一组开展常规蛋白质组学分析，通过对比良恶性病变间的差异分子，筛选出候选糖蛋白标志物。验证阶段纳入包含IPMN、MCN、SCN等多种PCN类型的独立队列（n=30），采用平行反应监测（PRM）靶向糖蛋白质组学技术，对发现队列筛选出的候选标志物进行定量验证，结合临床病理数据评估其诊断效能。

图1.本研究的主要研究过程

研究结果
1.PCN患者囊液的糖蛋白质组学与蛋白质组学图谱
通过对16例PCN患者囊液样本的糖蛋白组学与蛋白组学分析，蛋白质组学层面共鉴定到3339种蛋白、20283条肽段，整体蛋白表达谱在不同类型PCN间存在基础差异，糖蛋白质组学层面共鉴定到9803种N-连接糖蛋白、21117个N-糖基化位点、176792条完整N-糖肽，相比常规蛋白质组，糖蛋白质组提供了更高维度的分子特征信息。

图2.发现队列中16例胰腺囊性肿瘤囊性液体样本的糖蛋白组学和蛋白质组学结果

2. IPMN恶性转化过程中囊液中糖蛋白及蛋白质的变化
为探究IPMN恶性转化过程中蛋白与糖蛋白的变化，本研究比较了浸润性IPMN（恶性）与低级别IPMN（良性）组之间差异表达的糖蛋白和蛋白质。结果显示糖蛋白组学在恶性与良性PCN之间表现出更显著的表达差异，差异分子数量更多（642 vs 312），聚类热图和PCA分析均表明其区分良恶性PCN的能力显著优于常规蛋白组学（图3）。

图3.侵袭性IPMN组与低度恶性IPMN组之间的差异糖蛋白和蛋白表达谱

为探究囊液糖蛋白的糖型变化与差异蛋白的通路特征，本研究对差异糖蛋白进行了糖型组成分析并利用PANTHER 系统对差异蛋白开展信号通路富集分析。结果显示：恶性IPMN中复杂型糖链与唾液酸化糖链显著上调，凝血、纤溶酶原激活、整合素信号、CCKR信号及Ras通路显著活化，提示这些特征可能参与了IPMN的恶性演进过程（图4）。

图4.IPMN恶性转化过程中囊肿液中糖蛋白和蛋白质变化的特征

3. 识别潜在囊液糖蛋白作为新型生物标志物区分恶性胰腺囊性肿瘤
为从差异表达的糖蛋白中筛选能准确区分良恶性PCN的囊液糖蛋白标志物，研究者将SCN和LG-IPMN归为良性组、inv-IPMN归为恶性组，筛选标准为：恶性组中≥4例检出、良性组0例检出。结果共筛选出7个候选糖蛋白，其中4个在恶性组特异性表达（ATP6V0A1、ATP6V0A4、CEACAM5及PHKB的特定糖型），3个在良性LG-IPMN中特异性表达，常规蛋白组学未筛出符合标准的任何蛋白标志物。质谱谱图确认了CEACAM5糖肽的鉴定可靠性。

图5.基于质谱的糖基化和糖型特异性糖蛋白组学，鉴定囊液糖蛋白中区分恶性PCNs的潜在生物标志物

4. 胰囊液糖蛋白生物标志物在鉴别胰腺囊性肿瘤恶性病变中的验证
为验证候选糖蛋白标志物区分良恶性PCN的诊断效能，研究者采用PRM靶向糖蛋白组学技术，以CEACAM5和PHKB为代表进行囊液样本检测。结果显示，PRM方法能够成功检测目标糖肽的母离子与特征碎片离子，谱图匹配良好，证实该方法可用于验证队列中候选标志物的靶向定量检测。在30例独立验证队列中，ATP6V0A4、CEACAM5和PHKB的特定糖型成功验证，AUC为0.771-0.948，敏感度66.7%-100%，特异度81.2%-93.8%，其中PHKB（H5N2F0S0）的AUC最高（0.948）。最终TCOF1被确认为低级别黏液性病变的标志物，PHKB、CEACAM5和ATP6V0A4的特定糖型可作为区分良恶性PCN的可靠囊液糖蛋白标志物（图6）。

图6.囊液糖蛋白生物标志物在鉴别恶性胰腺囊性肿瘤中的验证

研究结论
本文通过囊液糖蛋白质谱分析（LC-MS/MS）结合平行反应监测（PRM）靶向质谱验证，筛选出PHKB、CEACAM5、ATP6V0A4的特定糖基化形式为高诊断效能的囊液标志物，其中PHKB糖型AUC最高达0.948，且仅需微量囊液即可检测，筛选的新型标志物可为PCN临床诊疗决策提供重要依据，PHKB、ATP6V0A4属于首次被证实与PCN恶性病变相关的糖蛋白，也为后续探索PCN发病机制、开发靶向治疗药物提供了全新靶点。本研究成功建立了基于质谱的PCN囊液糖蛋白质组学分析体系，证实了糖蛋白质组学在肿瘤液体活检中的独特优势，为其他癌前病变（如结直肠腺瘤、Barrett 食管）的标志物筛选提供了新思路。