胞内复杂的生化环境（如大分子浓度高、不同细胞器区域大分子富集种类不同等），与体外实验环境有根本性的差异。我们不能将细胞简单地视作为一个大分子袋“bag of macromolecules”，更应该理解为由细胞器空间结构效应，及其生物活性紧密耦合构成的“智慧体”。因此，简单的使用体外实验结果去推断胞内生化活动是不准确的，这也正是当下“原位结构生物学”和“细胞内生物化学”兴起的原因。

细胞内部采用区室化管理模式，通过生物分子间相互作用强弱和特异性，形成不同的物理状态。基于“液-液相分离”理论，较弱且多价的相互作用形成生物分子聚集体，即无膜细胞器。其具有相对灵活的运行机制，能够快速响应胞内生化环境变化；强特异性相互作用则会形成稳定的固态组装体，能够锁定生物分子，进行长期存储。

在细胞内，生物分子聚集体和固态组装体并不是一成不变的，而是一种动态连续的过程。比如，传统观点认为受细胞代谢状态变化的影响，代谢酶可通过组装形态变化增强内在催化活性。而越来越多的研究者发现，这种形态变化同样受制于空间效应，以便在复杂的胞内生化环境中，调控生物分子的扩散距离、局部浓度和酶稳定性。目前，这类细胞内生物大分子组装体，在细胞生理活动中的作用仍然是个谜。这就需要我们在天然细胞环境下开展研究工作，并将其功能与结构相结合，揭示这些组装体背后的秘密。

Cryo-ET技术能够在“接近天然含水状态”的完整细胞里，看清单个蛋白质分子原子级排布，揭示出与体外纯化实验截然不同的架构和功能状态。在该研究工作中，作者以小鼠肝脏的过氧化物酶为研究载体，发现了一种从未描述过的超分子组装体，解析了其组成、架构、机制、酶活性和进化保守性，突破性地发现了该高阶组装支持其发挥功能，却不改变内在催化活性的特征。

本推文将围绕2-甲基戊烷高压冷冻路线，首先详细介绍实验方法与步骤，接着重构所得小鼠肝脏cryo-ET数据，并解析尿酸氧化酶（UOX）原位结构和功能。

Figure 1：小鼠肝细胞过氧化物酶体中，尿酸氧化酶（UOX）超分子组装结构。a. 高压冷冻制备小鼠肝脏组织所得的1.1 nm厚度切片图像。其中，黄色箭头所指为过氧化物酶体中的UOX超分子组装结构。其中，Pero为过氧化物酶体；Mito为线粒体；标尺为100 nm；b. 切片a区域的3D重构结果。其中，黄色代表线粒体；品红色代表内质网膜；灰色代表核糖体；绿色代表过氧物酶体；橙色代表UOX组装结构。图中标尺为100 nm；c-d. c为UOX组装结构顶部切片视图，d为相应的概览图。图中标尺为10 nm；e-f. e为UOX组装结构侧视图，f为相应的概览图。图中标尺为10 nm；g-h. g和h分别为UOX组装结构中，最小重复结构的概览图和子断层图像平均图；i-j. i和j分别为UOX组装结构中，单根螺旋纤维的概览图和子断层图像平均图；k. 从断层扫描中测得的过氧化物酶体直径分布的violin 图；l. 含有不同数量UOX组装结构的过氧化物酶体数量；m. 上图为小鼠尿酸氧化酶单颗粒冷冻电镜图像，下图为原子模型。


Supplementary Figure 1：小鼠肝脏组织冷冻电子断层扫描结果a. 组织样本冷冻电子断层扫描制样路线和小鼠肝脏组织数据采集方法；b-f. 上述制样路线所获得的小鼠肝脏断层扫描数据。其中，黄色箭头指向尿酸氧化酶（UOX）超分子组装结构。图中标尺为100 nm；g. f切片区域的3D重构结果。其中，黄色代表线粒体；品红色代表内质网膜；灰色代表核糖体；绿色代表过氧物酶体；橙色代表UOX组装结构。图中标尺为100 nm；h. UOX组装结构不同Z轴位置切片图像，左中右分别为底部、中间和顶部切片。图中标尺为10 nm。

实验试剂：
2-甲基戊烷；PBS缓冲液（20% w/v葡聚糖+5% w/v蔗糖）；乙烷和丙烷混合气（比例为：36.9%:63.1%）

耗材：
200目载网（碳支持膜）；6 mm Type A高压冷冻铜盘；6 mm蓝宝石片

实验步骤（Supplementary Figure 1a）：

1. 使用辉光放电仪对载网进行亲水化处理，每次须使用刚处理的载网；
2. 在高压冷冻仪中，装载半圆弹道、中间板、垫圈和6 mm Type A铜盘，200 μm凹槽向上，放入载网；
3. 解剖小鼠，取肝脏组织切片，在含有葡聚糖和蔗糖的PBS缓冲液中，浸泡30秒；
4. 将肝脏组织切片放置于载网上；
5. 在铜盘槽内滴加2-甲基戊烷；
6. 盖上6 mm蓝宝石片；
7. 合上高压冷冻盖板，完成高压冷冻实验；
8. 将铜盘、载网、样品和蓝宝石在液氮环境下，转移到-170摄氏度液态乙烷和丙烷混合液中，溶解2-甲基戊烷；
9. 将载网和样品在液氮环境下，转移并储存，待下一步进行FIB减薄制备lamella。

研究者们使用了组织样品制备路线，解析了小鼠肝脏组织的亚细胞结构，可视化了众多细胞器及其相互作用，验证了肝脏组织代谢中心的作用（Supplementary Figure 1）。在研究过程中，意外地在单层膜细胞器中观察到了一种大型超分子组装体，并且其具有明显的周期性模式（Figure 1a-b, Supplementary Figure 1b-g）。在这些组装体中，能够观察到平行的丝状单元，其间距约为4或者8 nm，数量从数个到数十个不等（Figure 1e-f, Supplementary Figure 1i）。其正交视图显示为空心管状结构，间距为10 nm，取向角为144°（Figure 1c-d, Supplementary Figure 1h）。同时，在三维结构中能够观察到，这些丝状单元最终会组成不规则弯曲的片状结构（Figure 1b, Supplementary Figure 1g）。UOX组装体的精细结构表明，其高阶组装是UOX同源四聚体之间通过弱的多价相互作用结合形成的，其中涉及数个短的结构基序。上述结构是一种从未被表征的细胞内组装体。

在结构上，UOX中空纤维架构的五重对称性，没有采用空间填充的晶体堆积方式，取而代之的是一种多孔的层状组织，在维持稳定性的同时最大化表面积。这种固态组装体，既能很好地保持底物可及性和产物扩散能力，同时赋予酶针对热、蛋白酶和氧化应激的显著保护。这种稳定化作用在过氧化物酶体环境中可能尤为有利，因为该环境富含过氧化氢（UOX催化反应的活性副产物）。

在该研究工作中，除了准确解析UOX结构以外，研究者们还详尽分析了UOX组装机制，深入解析了其几何结构的作用。并且，尽管该结构在人类进化中丢失，但仍在小鼠体内保持，以此提出了对临床转化的启示。

通讯作者介绍：
郭强，现任北京大学生命科学学院研究员，北大-清华生命科学联合中心研究员。他专注于原位结构生物学研究，其团队以冷冻光电联用（CLEM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）为核心技术，致力于在近生理条件下对亚细胞结构进行高分辨率三维成像，旨在从“细胞建筑学”（亚细胞结构如何构建功能细胞）和“生物大分子社会学”（大分子与细胞器间的相互关系）两个层面，揭示生命活动的基本规律。他曾获多项重要荣誉，包括2024年北京市杰出青年科学基金、2021年拜耳学者和博雅青年学者等。

文章使用Leica EM ICE多功能高压冷冻仪可实现200μm厚组织无冰晶玻璃化固定，兼容各类电镜载网，有效适配大组织样品原位冷冻电镜断层成像整套实验流程。

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