KLF2-BMPER-Smad1/5检查点调控高流体剪切应力介导的动脉重塑

A KLF2-BMPER-Smad1/5 checkpoint regulates high fluid shear stress-mediated artery remodeling

Keywords: fluid shear stress, vascular remodeling, artery outward remodeling, KLF2, BMPER, Smad1/5, BMP9/10

动脉重塑是一个复杂的过程，涉及结构变化，可以向内重塑以缩小或向外重塑以扩张腔径。冠状动脉疾病（CAD）和外周动脉疾病（PAD）中的病理性血管重塑导致组织缺血和疾病症状。血管内层的内皮细胞（ECs）持续暴露于血流中，产生一种称为流体剪切应力（FSS）的摩擦阻力。目前的研究证据支持，EC编码一个介导动脉重塑稳态的FSS设定值。动脉血流增加或减少分别刺激向外或向内重塑。根据这一观点，低FSS刺激内向重塑，生理FSS稳定血管以抑制重塑，高于生理的FSS促进外向重塑。

骨形态发生蛋白（BMPs）是血管发育、完整性、炎症反应和胰岛素敏感性的重要调控因子。BMP结合内皮调节因子（BMPER）是一种主要表达于ECs中的分泌蛋白，能结合BMPs和BMP受体，调节内皮细胞及可能邻近平滑肌细胞中的BMP信号。BMPER在血管生成、动脉粥样硬化、炎症和糖尿病等疾病相关血管过程中发挥重要作用。

美国耶鲁大学心血管研究中心、贝勒医学院心血管研究科及英国牛津大学发育与再生医学研究所团队曾在报告中指出，低FSS激活Smad2/3，诱导动脉内向重塑。其后续的研究旨在阐明高血流量诱导的动脉外向重塑的机制。结果发现，Klf2表达升高会诱导BMPER终止Smad1/5激活，从而解除Akt的抑制允许重塑，还表明人为阻断Smad1/5能有效挽救1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）小鼠的不良重塑。因此，阐明动脉外向重塑的关键机制暗示了治疗缺血性疾病的潜在方法。
研究成果发表于 Nature Cardiovascular Research 期刊题为“A KLF2-BMPER-Smad1/5 checkpoint regulates high fluid shear stress-mediated artery remodeling”。

以往研究发现，Smad1/5在生理FSS时被最大程度激活，在高（即超生理水平）FSS时被抑制。KLF2及其近同源Klf4是FSS诱导的主要EC转录因子。因此，研究测试了高FSS下Klf2在Smad1/5抑制中的作用。HUVECs先用对照组（siCtrl）和KLF2（siKLF2）siRNA处理，然后暴露于FSS 以3 dynes/cm/2 （低）、12 dynes/cm/2 （生理）或40 dynes/cm/2（高）的幅度处理12小时，检测Smad1核易位作为其激活标志。在对照组细胞中，核Smad1在生理剪切应力时最大程度进入细胞核，随后在高FSS时受到抑制；在KLF2敲低（KD）细胞中，核Smad1在低FSS和生理FSS下与对照组相似，但在高FSS下仍在细胞核内（图1 a-b）。通过免疫染色和蛋白质印迹法测定Smad1/5磷酸化显示的结果相似（图1 c-f）。因此，在高FSS下KLF2是抑制Smad1激活的必要条件。

随后，在有无KLF2 KD的HUVECs上进行了RNAseq，重点关注与BMP通路相关且在KLF2 KD后下降的基因。结果观察到，BMPER在高流量时表现出Klf2依赖性的诱导。数据表明，BMPER很可能是ECs中Klf2/4的直接靶基因。

为测试其功能，HUVECs被转染对照（siCtrl）或BMPER（siBMPER）siRNA，然后在FSS中以3、12和40 dynes/cm² 处理12小时。与KLF2 KD类似，BMPER KD在低FSS或生理FSS下效果有限，但在高FSS下有效阻断Smad1核易位和磷酸化的减少。这些结果表明，高FSS抑制Smad1/5需要KLF2依赖性的BMPER诱导。

图1 KLF2介导高FSS诱导的Smad1/5抑制

进一步地，为了在体内研究高FSS，构建了一个动静脉瘘（AVF）模型，其中右颈动脉（RCA）与外颈静脉相连（图2 a），导致两侧血流量较大。与对照LCA相比，手术后的RCA周长在第3天显著增加，14天时又进一步增加（图2 b-c）。这些结果显示手术后有强烈的外向重塑。目前尚无适合针对Klf2的抗体，但其共调控同源物Klf4的染色显示，RCA显著高于LCA，支持手术后RCA的剪切应力升高。BMPER免疫染色在近端RCA中显著增加，而LCA中表达几乎检测不到（图2 d-e）。相比之下，近端RCA的Smad1/5磷酸化较低，这与高剪切时的下降相符（图2 f-g）。这些结果表明，在高FSS条件下BMPER的诱导与动脉外向重塑过程中Smad1/5失活相关。

据报道，Smad1/5通路抑制VEGFR2和Akt的激活，表明Smad1/5在生理FSS下抑制VEGFR2和Akt，以稳定血管并防止不必要的血管重塑。然而，在高FSS下抑制Smad1/5会释放该抑制，从而实现外部重塑。这一假设预测，在高FSS动脉中，抑制BMPER可能会提升Smad1/5，降低Akt活性。随后，研究人员确认Akt被高FSS激活。为测试BMPER对高FSS下Akt激活的影响，使用对照组（siCtrl）或BMPER（siBMPER）siRNA处理的HUVECs在40 dynes/cm²下进行FSS，发现 BMPER KD降低了高FSS下的Akt激活。因此，在高FSS条件下的BMPER诱导有助于Akt激活。

为研究BMPER在体内的效果，生成内皮特异性BMPER敲除小鼠（BMPER iECKO），使用后肢缺血（HLI）模型测试了BMPER的作用，发现BMPER ECKO严重损害了血流恢复速度。对组织切片进行SMA染色以识别肌肉动脉，观察到WT小鼠中，平行于结扎的大腿组织比未手术的大腿组织有更高的肌肉动脉密度，表明动脉生成。在BMPER ECKO小鼠组织中，结扎的大腿肌肉动脉与对照组相比没有增加。对照组与BMPER iECKO小鼠也接受了AVF手术。术后第3天，近吻合口近端RCA或对照LCA相似位置的连续剖面显示，BMPER ECKO损害了外向重塑。对照组近端RCA诱导了BMPER表达，但在BMPER iECKO小鼠中未实现。对照组近端RCA的Smad1/5活化被抑制，但在BMPER iECKO小鼠中仍保持较高。这些数据共同提供了体内证据，表明BMPER上调抑制了Smad1/5，从而允许动脉向外重塑。

图2 高FSS介导的外重塑AVF模型

FSS激活Smad1/5需要可溶性BMP9和10的存在，分别是由肝细胞和心肌细胞产生的循环因子。因此，用 BMP9/10阻断抗体（bAbs）阻止Smad1/5 的激活。BMPER iECKO和对照小鼠接受HLI治疗后，每周一次腹腔注射对照IgG或BMP9/10 bAbs（图3 a）。BMP9/10 b Abs有效逆转BMPER iECKO后血流恢复不良（图3 b-c），动脉化也有相应改善（图3 d-e）。BMP9/10 bAbs还恢复了HLI模型中BMPER iECKO小鼠血管新生因子Vegfa和Pdgfb的表达。这些结果证实，BMPER通过BMP-Smad1/5通路起作用。

此外，为探讨BMP9/10b Abs是否能改善T1D患者的血流恢复速度，在C57BL/6小鼠中采用了链脲佐菌素（STZ）模型。确诊高血糖的小鼠接受HLI手术后注射对照IgG或BMP9/10 bAbs，发现 BMP9/10 bAbs显著改善了血流恢复速度，及大腿动脉化，小腿血管生成略有增加。这些结果表明，BMP9/10阻断Abs在缺血性疾病中抑制Smad1/5通路具有治疗潜力。

同时，在喂食高脂饮食诱导的T2D模型中，如预期，T2D小鼠的HLI恢复率显著降低，雌鼠的抑制更强。但BMP9/10 bAbs显著改善了雄性和雌性小鼠的血流恢复速度，及大腿动脉化，并适度增加小腿血管生成。在BMP9/10 bAbs处理后，Akt活化和BMPER表达也恢复了。这些结果表明，抑制Smad1/5通路为改善缺血性疾病的稳态重塑提供了一种手段。

图3 BMP9/10阻断抗体 Abs 恢复BMPER iECKO HLI模型中的血流速度

总之，该研究报告了高FSS通过提高KLF2抑制Smad1/5，KLF2诱导BMP通路抑制剂BMPER，从而去抑制Akt。在小鼠中，手术诱导的高FSS使BMPER表达升高，Smad1/5失活，并诱导血管外向重塑。内皮BMPER缺失损害了血流恢复速度和血管重塑。用BMP9/10阻断抗体阻断EC Smad1/5活化，改善了1型和2型糖尿病小鼠模型中的血管重塑。因此，抑制Smad1/5是治疗缺血性疾病的潜在方法。

参考文献：
Deng H, Zhang J, Wang Y, Joshi D, Pi X, De Val S, Schwartz MA. A KLF2-BMPER-Smad1/5 checkpoint regulates high fluid shear stress-mediated artery remodeling. Nat Cardiovasc Res. 2024 Jul;3(7):785-798. doi: 10.1038/s44161-024-00496-y. Epub 2024 Jul 8. PMID: 39196179; PMCID: PMC12306366.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39196179/

Journal Impact Factor: 10.8 (2024)

ISSN 2731-0590 (online)

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