Caspase-6是剪切诱导的体外肺动脉内皮细胞形态适应的非凋亡性效应子

Caspase-6 Is a Non-Apoptotic Effector of Shear-Induced Morphological Adaptation in Pulmonary Artery Endothelial Cells In Vitro

Keywords: caspase-6; caspases; endothelial cells; fluid flow; mechanoadaptation; mechanotransduction; morphological adaptation; shear stress; vascular biology.

流体剪切应力是一种由血液流动产生的基本生物力学力，维持血管稳态并控制内皮功能。内皮细胞的形态适应，特别是其在血流诱导的剪切应力方向上的伸长和轴向对齐，是功能性剪切响应最可靠的指标之一，也是血管健康的结构标志。内皮细胞对剪切应力的适应发生在不同阶段。早期反应在几秒到几分钟内，涉及通过磷酸化级联反应、离子通量（例如Ca2+），以及短暂性细胞骨架变化的快速信号传导。持续数小时到数天的适应需要长期的结构调整，包括肌动蛋白丝的排列和稳定、剪切纤维的形成、细胞间连接的强化、黏着斑的重组以及细胞核的重新定位。虽然早期信号传导的分子基础已被阐明，但驱动这些晚期结构重塑过程的机制仍然不完全清楚。
Caspases（半胱氨酸蛋白酶）家族主要被认为是细胞凋亡的起始和执行者，同时也是炎症的介导者。除了凋亡和炎症外，越来越多的证据表明，当其激活在空间和时间上受限时，可以触发细胞内非凋亡事件。Caspase-6由CASP6编码，被归类为介导细胞凋亡过程中核收缩和碎裂的效应子，具有与其他 Caspases 不同的独特激活和调控机制。值得注意的是，与Caspase-3和Caspase-7相比，Caspase-6 是相对较弱的凋亡诱导因子，通常在 Caspase-3 下游被激活，而非被起始者 Caspase 直接激活，且在某些情况下也可能发生自激活。Caspase-6在底物特异性上也不同于其他Caspase，它优先切割对核力学和细胞骨架组织至关重要的蛋白质。这些Caspase-6底物对于持续剪切适应所需的晚期结构重塑尤为重要，如核重新定位和细胞骨架重排。综合这些特性，使 Caspase-6 成为调节内皮结构对机械应力适应的有趣候选者。
假设Caspases通过非凋亡性的蛋白水解活性，参与剪切诱导的内皮细胞形态适应。为验证这一点，德国柏林夏里特医学院生理学研究所、德国心血管研究中心团队在一项研究中系统性地抑制了暴露于层流剪切应力下的单个Caspases，并监测肺动脉内皮细胞（hPAEC）的排列和伸长，指出Caspase-6在hPAEC剪切适应中扮演了新角色，区别于其在凋亡中的传统功能。
研究成果发表于CELLS 期刊题为“Caspase-6 Is a Non-Apoptotic Effector of Shear-Induced Morphological Adaptation in Pulmonary Artery Endothelial Cells In Vitro”。

首先，为研究caspases 是否参与hPAEC对血流的形态适应，在hPAEC体外暴露于单向连续层流剪应力期间，使用特定caspases抑制剂进行了功能筛选。hPAEC通过两步方案进行剪切调节，24小时低剪应力（LSS，2.5 dyn/cm2）和72小时的高剪应力（HSS，15 dyn/cm2）。在剪切刺激前一小时加入caspase抑制剂，并在整个暴露期间保持使用。
与静态对照和24小时的LSS相比，暴露于HSS会诱导逐渐性的形态适应，细胞在48小时内变得细长并沿流动方向排列。在用caspase -1/4/5、caspase-2、caspase-3/7、caspase-8/10和caspase -9抑制剂处理的hPAEC中也观察到了类似的形态学适应。值得注意的是，caspase-6特异性抑制完全阻止了适应性剪切力的响应，因为hPAEC在HSS持续72小时后没有伸长且缺乏定向排列（图1 A）。
虽然所有组在早期时间点都表现出很大程度的不适应，但在除caspase-6抑制外的所有条件下，形态学上的剪切适应在48小时和72小时时变得越来越明显（图1 B）。具体来说，对照组hPAEC在24小时LSS时的15.8%上升至72小时HSS后的75.2%，而caspase-6抑制的hPAEC仅表现出最小的适应性，从24小时LSS的1.2%升至72小时HSS后的5.5%。
对四个独立生物复制体的重复实验证实了上述发现的可重复性。与对照组相比，抑制caspase-6在HSS暴露48小时（49.8% vs 24.8%）和72小时（63.1% vs 32.4%）时均显著降低剪切适应性（图1 C）。
这些结果表明，caspase-6在流体流动诱导的hPAEC重塑中具有非冗余的机械适应性作用，因为抑制其他caspases没有类似的效果。

 

图1 Caspase-6在hPAEC中对流体剪切应力的形态适应中是特别必要的

在确认caspase-6是剪切诱导的形态适应所特有的必要成分后，接下来，进一步探讨其作用是否延伸至非血流驱动的其他hPAEC伸长形式，因此，评估了抑制caspase-6在体外三种刺激下的影响：单轴循环拉伸、TNF-α刺激‌和微加工基底（micropatterned substrate confinement）。将hPAEC进行循环拉伸（1 Hz，5%应变）24小时，对照细胞和caspase-6抑制细胞均表现出明显的垂直于应变轴线（90°）的伸长，这与hPAEC已知的机械生物学行为一致（图2 A）。取向分布的傅里叶分量分析显示，各组间无显著差异（图2 B），表明caspase-6不影响拉伸刺激下机械敏感性的细胞伸长。
接着，使用微加工基底评估物理约束下的形态反应。对照组和caspase-6抑制的hPAEC均正常附着于图案，并根据底层几何调整形态，表现出沿图案的伸长和排列（图2 C）。纵横比定量结果显示组间无显著差异（图2 D），表明caspase-6并非空间限制下hPAEC伸长的必要条件。
最后，用10 ng/mL的促炎细胞因子TNF-α刺激hPAEC 24小时。对照组和caspase-6抑制的细胞对TNF-α的响应明显伸长（图2 E），且因caspase-6抑制导致的纵横比无显著差异（图2 F）。
这些发现表明，caspase-6在hPAEC对机械、环境或血管激活线索的形态适应中并非广泛必需，而是在持续血流介导的机械适应过程中特别参与。

图2 Caspase-6在非剪切形态适应反应中是必不可少的

基于上述发现，研究人员进一步研究caspase-6活性是否有助于hPAEC功能反应，特别是细胞运动性。由于形态适应和迁移都依赖肌动蛋白细胞骨架重塑，因此研究了caspase-6是否影响hPAEC的定向迁移和伤口愈合能力。为此，采用了两种互补检测方法：细胞电阻抗传感技术（ECIS）和机械划痕实验。高频电脉冲损伤后恢复动力学在对照组和caspase-6抑制细胞之间具有可比性（图3 A）。两组的基线屏障阻力恢复到相似水平（图3 B），完全恢复的总时间相当（~5小时，图3 C）。同样，hPAEC的机械划痕测定也未发现伤口愈合率有显著差异。损伤后9小时，两组愈合水平相似（图3 D），定量分析确认迁移率相同（图3 E）。在这两种条件下，完全愈合时间均为约12小时。这些发现表明，caspase-6抑制不会影响hPAEC的运动性、定向迁移或损伤后屏障恢复，进一步强化了caspase-6特异性调控血流诱导重塑的事实。
最后，为了精确定位剪切诱导适应期间caspase激活的时间和亚细胞定位，使用双重切割敏感融合生物传感器对caspase-6 和 caspase-3 进行了活细胞共聚焦FRET成像。归一化FRET（NFRET）定量显示，caspase-3活性在整个时间过程中基本保持不变。相比之下，caspase-6活性在暴露约18小时HSS后开始上升，并逐步增加。32.75小时后，caspase-6活性显著偏离caspase-3，33小时达到最大活化，并在36小时内保持升高。即Caspase-3保持不活跃状态，而caspase-6在 ~20至36小时间表现出明显的核周定位激活。这些发现表明，caspase-6，而非caspase-3，在持续HSS期间被特异性和短暂性激活。激活与可见形态适应的开始同时发生，其核周围定位表明，caspase-6可能作为非凋亡效应子，将机械力与核周围细胞骨架和/或核重塑联系起来。

图3 Caspase-6抑制不影响hPAEC定向迁移、伤口愈合或损伤后屏障恢复

综上，该研究确认Caspase-6为非凋亡性的、剪切特异性效应子，是层流剪切应力下hPAEC形态学适应所必需的。其激活相较于早期机械感应时间是延迟的，空间上限制在核周围区域，且与其他Caspase不同。Caspase-6在其他形态和功能适应中是必不可少的，凸显了其特定微环境中的作用。这些发现拓宽了Caspase的功能范围，并将蛋白酶介导的结构重塑作为血管机械生物学中的关键组成部分引入了研究。

参考文献：
Wittig C, Akmeriç EB, Michalick L, König JM, Kuebler WM, Gerhardt H, Szulcek R. Caspase-6 Is a Non-Apoptotic Effector of Shear-Induced Morphological Adaptation in Pulmonary Artery Endothelial Cells In Vitro. Cells. 2025 Oct 25;14(21):1669. doi: 10.3390/cells14211669. PMID: 41227316; PMCID: PMC12609614.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41227316/
Cells - ISSN 2073-4409
IF：5.2
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