射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）占全球心衰患者半数以上，因发病机制异质性强、缺乏理想研究模型，始终缺乏针对性有效治疗手段，是心血管领域公认亟待解决的重大临床难题。既往HFpEF研究高度依赖啮齿类动物模型，存在显著种属差异，难以复刻人类微血管功能障碍、慢性炎症介导的病理特征，也无法精准支撑人源化药物筛选。

近期，日本藤田医科大学Shugo Tohyama团队联合京都大学iPS细胞研究所等机构，在干细胞领域顶刊Cell Stem Cell（IF 25.3）发表重磅研究。首次利用人诱导多能干细胞（hiPSC）构建出包含心肌细胞、内皮细胞、心外膜细胞的3D工程化心脏组织（hEHT），通过高脂肪酸与一氧化氮合酶抑制双重负荷，在体外稳定复刻了HFpEF“收缩功能保留、舒张功能障碍” 的核心表型；并基于该模型系统证实SGLT2抑制剂恩格列净可通过恢复内皮细胞eNOS-NO-cGMP-PKG通路、减轻钠钙超载发挥舒张保护作用，为HFpEF病理研究与药物开发提供了全新的人源化实验平台。


研究背景
1. HFpEF的临床与模型困境：HFpEF以左室舒张功能障碍为核心，合并高血压、肥胖、糖尿病等多系统合并症，预后差且治疗手段有限；传统动物模型受种属差异限制，无法完全复现人类心肌电生理、蛋白亚型与病理重塑特征，新药研发转化成功率极低；FDA已明确支持hiPSC体外模型作为动物实验的替代方案。

2. HFpEF的微血管-炎症致病假说：当前主流观点认为HFpEF是合并症驱动的系统性疾病，微血管内皮功能障碍、eNOS-NO-cGMP-PKG通路失活、慢性低度炎症是核心病理环节，但始终缺乏人源组织模型对该机制进行直接验证与定量研究。

3. 前期技术与临床基础：Tohyama团队已建立成熟的hiPSC心室肌细胞分化与3D工程化心脏组织（EHT）构建技术，可制备长期稳定收缩的人源心肌组织；临床研究已证实SGLT2抑制剂可改善HFpEF患者预后，但其心肌直接保护机制、细胞靶点尚未完全阐明。

核心问题
1. 能否通过病理负荷干预，在hiPSC来源的3D工程化心脏组织中稳定复刻HFpEF“收缩保留、舒张受损” 的核心功能表型？
2. 该体外模型能否复现HFpEF的微血管内皮功能异常、炎症激活、细胞外基质重塑等病理特征？
3. SGLT2抑制剂等临床候选药物在该模型中的疗效如何，其舒张保护作用的细胞靶点与分子机制是什么？

本研究依托hiPSC构建多细胞组分的人源工程化心脏组织，结合功能成像、转录组学、基因编辑与临床药物筛选开展系统性研究，功能学检测依托运动追踪成像与荧光标测技术完成：
1. 模型构建：以hiPSC分化的心室型心肌细胞为核心，搭配心外膜细胞、内皮细胞、巨噬细胞多种细胞组分，复合心脏来源胶原与纤维蛋白构建3D工程化心脏组织（hEHT）；采用高脂肪酸（AlbuMAX）联合L-NAME（eNOS抑制剂）的双重负荷诱导HFpEF样病理表型，设置无脂肪酸负荷的正常组织为对照。

2. 功能检测：采用运动成像系统非侵入式记录组织收缩力、心率、收缩/舒张时长，核心舒张功能指标为舒张时长/收缩时长比值（RD/CD）；结合Cal-520钙荧光探针同步记录组织钙瞬变；采用微压缩系统定量组织整体僵硬度。

3. 分子与组学分析：通过qRT-PCR、全基因组表达谱芯片、毛细管Western blot、ELISA等技术，分析心衰标志物、钙处理蛋白、纤维化通路、炎症因子及eNOS-cGMP-PKG通路蛋白表达；采用ICP-MS定量组织总钠、总钙含量，结合离子荧光探针检测单细胞水平钠钙稳态。

4. 超微结构与形态：通过免疫荧光染色标记心肌、内皮、纤维化标志物，透射电镜观察肌小节、线粒体、内质网等超微结构变化。

5. 机制与靶点验证：通过调控内皮细胞比例与亚型、加入M1/M2巨噬细胞、CRISPR-Cas9构建NOS3敲除细胞系，结合通路抑制剂（PKG抑制剂、NHE/NCX抑制剂）验证病理与药物作用的核心靶点。

6. 药物筛选体系：测试ARNI、SGLT2i、sGC激动剂、PDE5抑制剂等6类临床心衰候选药物，验证SGLT2i的量效关系及预防/治疗双模式效应。

研究结果
1. 人源HFpEF体外3D模型精准复刻临床核心病理特征
经过2周高脂肪酸+L-NAME负荷的hEHT完整复现了HFpEF的功能与结构特征：收缩力、心率与对照组无显著差异，符合 “射血分数保留” 的表型；舒张时长显著延长，RD/CD比值升高，钙瞬变舒张回落减慢，呈现典型舒张功能障碍。

结构层面可见心肌细胞肥大、纤连蛋白沉积增加、组织纤维化；肌联蛋白亚型向僵硬型N2B偏移，I/III型胶原比值升高，共同介导组织僵硬度上升；透射电镜下可见线粒体嵴断裂、脂质沉积、内质网扩张，与临床HFpEF患者心肌超微结构高度一致。

分子层面心衰标志物NPPB显著上调，钙处理相关基因（RYR2、SERCA2A、PLN）下调；培养基上清NT-proBNP、IL-6早期升高，可实现无创动态监测疾病进程。

图1. 对照组与HFpEF模型hEHT的构建流程及收缩舒张功能表型

研究通过多维度功能检测体系交叉验证表型可靠性：使用活细胞运动成像系统对5组梯度浓度病理负荷连续8周非侵入式追踪，证实舒张功能损伤出现早、呈剂量依赖性，收缩力下降则在4周后才显现，最终确定2% AlbuMAX+1 mM L-NAME为最优造模条件，2周即可稳定呈现 “收缩保留、舒张受损” 的典型HFpEF表型。

采用Cal-520钙荧光探针检测到HFpEF组钙瞬变舒张回落减慢，结合组织形变距离独立分析，交叉印证了非侵入式功能检测的稳定性与准确性；同时通过微压缩系统，以5%形变量下的力-位移比值为指标，证实HFpEF组组织僵硬度显著升高，从生物力学层面直接支撑舒张功能障碍的表型。

图S1. 心衰造模培养基可呈浓度、时间依赖性诱发工程化心脏组织功能损伤

视频S1. 对照组与HFpEF模型hEHT的运动

2. 多药物筛选证实SGLT2i可特异性改善舒张功能，兼具预防与治疗效应
对6类临床心衰候选药物进行筛选后发现，仅恩格列净（SGLT2抑制剂）可显著降低RD/CD比值、改善舒张功能，同时下调BNP表达、恢复钙处理基因与肌联蛋白亚型平衡；其余药物无明确舒张获益，HCN通道抑制剂甚至加重舒张障碍。

浓度梯度验证显示，0.3~1 μM低浓度恩格列净即可发挥最优舒张保护作用，高浓度获益反而下降，存在明确的治疗浓度窗。给药模式验证证实，造模同时给药的预防模式效果最强，造模1周已出现舒张损伤后再给药的治疗模式仍可显著逆转表型。

图2. 多类心衰药物筛选结果及SGLT2i的量效关系与给药模式验证

3. 转录组解析炎症-纤维化通路激活，SGLT2i通过抗炎效应改善病理
全基因组表达谱分析显示，HFpEF模型差异基因显著富集于炎症免疫激活、细胞外基质胶原重构通路，IL-6、IL-1β、ANGPTL4等临床HFpEF相关分子显著上调，与患者心肌组织转录特征高度匹配。

SGLT2i处理后，炎症相关通路被显著抑制，ECM纤维化程度减轻，抗凋亡与代谢调控通路上调；其中NLRP3炎症小体通路在模型中显著激活，SGLT2i可特异性抑制其活性。培养基蛋白检测同步验证，模型组IL-6分泌升高，SGLT2i可同时降低IL-6与NT-proBNP水平。

图3. HFpEF模型与对照组的转录组差异及SGLT2i干预后的通路变化

4. 内皮细胞是病理发生与药物起效的核心介导者，eNOS-cGMP-PKG通路为关键轴
内皮细胞比例梯度实验显示，内皮细胞占比越高，HFpEF造模后的舒张损伤越重、BNP升高越显著；无内皮细胞的hEHT中，SGLT2i几乎无法发挥舒张改善作用，直接证实药物效应依赖内皮细胞存在。

通路验证表明，HFpEF模型中内皮eNOS表达下调，组织cGMP含量降低，PKG活性下降，eNOS-NO-cGMP-PKG通路整体失活；SGLT2i可通过促进AMPK磷酸化恢复内皮eNOS表达与通路活性。PKG抑制剂可部分复刻HFpEF舒张表型，且PKG抑制后SGLT2i无法发挥改善作用，证实该通路是药物起效的必需环节。

Transwell共培养进一步验证，单独培养的心肌细胞无法诱导eNOS下调，与内皮细胞共培养后才出现通路失活，支持内皮-心肌细胞互作在病理中的核心作用。

图4. 内皮细胞比例对HFpEF表型的调控及eNOS-cGMP-PKG通路验证

5. 巨噬细胞放大炎症表型，NHE/NCX介导的内皮钠钙超载是上游机制
巨噬细胞验证实验显示，无论是否加入巨噬细胞，复合病理负荷均可诱导舒张功能障碍，说明巨噬细胞并非病理发生的必需条件；但M1 促炎型巨噬细胞会显著加重舒张损伤、升高IL-6与BNP水平，M2a抗炎型巨噬细胞则减轻表型，发挥炎症调控的放大效应。

通路抑制剂筛选定位钠氢交换体（NHE）、钠钙交换体（NCX）为上游靶点：NHE抑制剂、NCX抑制剂均可模拟SGLT2i的舒张改善效果。ICP-MS与单细胞离子检测证实，HFpEF模型组织钠钙总量显著升高，钠钙超载同时存在于心肌细胞与内皮细胞；SGLT2i主要作用于内皮细胞，抑制NHE、NCX的表达上调，减轻内皮钠钙超载，进而恢复eNOS功能。

图5. SGLT2抑制剂的抗炎机制阐释

6. NOS3基因敲除验证内皮eNOS的必要性，不同内皮亚型均支持病理诱导
对人脐静脉内皮（HUVEC）、心脏微血管内皮（HCMEC）及 hiPSC 诱导动、静脉内皮的对比实验显示，上述各类内皮细胞加入工程化心脏组织后，均能支持 HFpEF 样舒张功能障碍表型形成；其中心脏微血管内皮（HCMEC）介导的 IL-6、NT-proBNP 炎症因子分泌水平高于脐静脉内皮，hiPSC 动脉内皮同样可诱发较强炎症应答，且 HCMEC 高表达心脏微血管特征内皮标志物。

CRISPR-Cas9构建的NOS3敲除细胞系验证显示：内皮细胞敲除eNOS本身即可导致hEHT舒张功能下降，造模后损伤进一步加重，且 SGLT2i的改善效果显著减弱；心肌细胞敲除eNOS也会加重舒张损伤，但SGLT2i仍能发挥部分作用，直接证明内皮eNOS是SGLT2i发挥舒张保护的核心靶点。

图6. NOS3敲除细胞系对病理表型与药物效应的验证

结论
本研究首次在人源3D工程化心脏组织中稳定复刻了HFpEF“收缩功能保留、舒张功能障碍” 的核心病理表型，突破了传统动物模型的种属差异局限，建立了可无创监测、适配高通量筛选的HFpEF体外研究体系，符合FDA新型替代实验方法的政策导向。

研究同时完整阐明了内皮eNOS通路失活-钠钙超载-炎症纤维化-舒张功能障碍的HFpEF致病轴，从细胞互作层面明确了内皮细胞的核心调控地位；并在人源组织层面证实SGLT2抑制剂的直接心肌舒张保护作用与分子靶点，为其临床HFpEF适应症提供了坚实的转化医学证据。该模型体系未来可广泛应用于HFpEF新药筛选、老药新用验证与个体化病理研究。