小鼠肺脏单细胞样本制备标准流程及步骤
2026-08-10 来源:本站 点击次数:57一、 实验前准备-全套试剂耗材
组织样本处理-所用全套试剂耗材
二、 样本取材及预处理
1、样本取材
2、组织解离前预处理-肺脏
● 迅速取出完整肺脏
● 清洗修剪：立即置于预冷的组织保存液 或PBS中，仔细去除气管、主支气管及肺门周围的脂肪和结缔组织。
● 机械解离，用锋利的眼科剪将其剪碎成 0.5-1 mm³ 的小块
三、 标准化组织解离步骤参考（以小鼠肺脏为例）
● 实验思路框架
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样本来源 |
C57 Mouse |
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取材 |
Lung |
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样本处理 |
通过消化酶处理为单细胞悬液 |
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分选目的细胞 |
● CD11B+Myloid髓系细胞 ● F4/80 MacroPhage巨噬细胞 ● CD8 T细胞 |
1、组织消化解离
(1) 酶消化：将组织块（约100-200mg）转移至离心管，加入 1 mL 组织解离液（难消化可延长）。
(2) 摇床孵育：将离心管置于 37℃恒温水平摇床，以 80-100 rpm 的转速孵育 30-40分钟。
(3) 70μm 细胞筛网过滤，预冷 1×PBS 3-5mL 冲洗筛网；
(4) 4℃、300g 离心 5min，弃上清，4mL 40% Percoll 重悬沉淀；
2、Percoll密度梯度液配置（40%、80%、100%）
100% Percoll溶液：
Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液
40% Percoll溶液：
用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按体积比4:6混合，配制40%等渗Percoll溶液。
80%Percoll溶液：
用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按体积比8:2混合，配制80%等渗Percoll溶液。
3、Percoll 密度梯度提取目的细胞
(1) 建立密度梯度：用4mL 40% Percoll溶液重悬细胞沉淀。在另一15mL离心管底部预先加入2.5mL 80% Percoll溶液。然后，极其缓慢地 将40% Percoll细胞悬液沿管壁加在80% Percoll液面上，形成清晰界面。
(2) 离心：在 20℃、800×g （升速 1、降速 0）条件下离心 20分钟
(3) 收集目标细胞：离心后，管中液体将分层。目标淋巴细胞和髓系细胞会集中在 40%与80% Percoll溶液的界面处，形成一层白色的云雾状细胞层。小心地用吸管将该层细胞吸出，转移至新管中。
(4) 加预冷 1×PBS，4℃、300g 离心 5min，弃上清；
(5) 细胞染色缓冲液重悬沉淀，备用。
4、细胞计数，活率测定&磁珠分选结果
● 取10-20μL细胞悬液，与等体积的 台盼蓝染液（0.4%） 混合
● 取适量混合液（通常10μL）加入计数仪专用的一次性计数载玻片
● 将载玻片插入仪器，自动分析细胞总浓度（cells/mL）、活细胞浓度和活率百分比
5、磁珠分选结果展示
四、小优有妙计--新手避坑核心要点
1. 组织样本如何延长保存时间？
盛有PBS或培养基的容器放冰上，采集的新鲜组织样本直接放在里面短暂转移处理；如需延长组织的保存时间可以用组织保存液abs9474-100mL（爱必信），4℃可保存48小时。
2. 什么情况下需要对组织样本进行纯化和预富集？
组织样本包括免疫组织和非免疫组织。其中，免疫组织：胸腺、脾脏、淋巴结等，免疫细胞占比高；非免疫组织：肿瘤、肝脏、肺脏、肠等，免疫细胞占比低。
当目标细胞在原始样本中占比过低，或存在大量干扰物质时，建议进行预富集，所以非免疫脏器最好过percoll，这是确保下游流式分析或分选实验成功可靠的关键。
实验所用试剂耗材
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产品分类 |
产品编号 |
名称 |
规格 |
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组织消化解离 |
小鼠肺脏组织解离试剂盒 |
10T/25T |
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筛网 |
70um细胞筛网（200目，白色，底面过滤） |
50个/箱 |
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免疫细胞预富集 |
percoll |
100ml |
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10XPBS缓冲液 |
PBS缓冲液（10×） |
500ml |
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1640培养基 |
RPMI 1640培养基（含L-谷氨酰胺，不含HEPES） |
500ml |
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红细胞裂解液（1×） |
RBC Lysis Buffer |
100ml |
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阻断FCR非特异性染色 |
S0B0599 |
Mouse FcR Blocking Reagent |
200T |
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染色缓冲液 |
Flow cytometry staining buffer |
500ml |
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流式鉴定 |
563168 |
BV711 Rat Anti-CD11b |
50ug |
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流式鉴定 |
565411 |
BV421 Rat Anti-Mouse F4/80 |
50ug |
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流式鉴定 |
563068 |
BV510 Rat Anti-Mouse CD8a |
50ug |
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流式鉴定 |
561037 |
APC-Cy™7 Rat Anti-Mouse CD45 |
100ug |