PBMC电转实验中出现了一个很典型的实验现象：第一次做的很好，第二次也不怎么好，换了另外一批供体之后结果忽然发生了明显的改变。因此实验人员又把电脉冲参数调回来。调整之后这一批样本好了，下一批又出现了不一样的问题。时间长了就会产生这样的一个印象：PBMC电转本身就是一个非常不稳定的实验。

实际上，PBMC电转实验要比很多传统的细胞系实验更易产生生物学变异，但是其中大部分的差异都是由于实验流程没有真正地标准化造成的：

1. PBMC是第一个生物样本，并不是标准试剂；
2. PBMC来自不同的个体，所以自然就存在着供体差异。
3. 由于人的年龄、生理状况和免疫细胞组成等都会造成样本之间的不同，所以样本之间会有差别。
4. PBMC是由多种不同的细胞亚群组成的，所以即使是两个样本总的细胞数目完全一样，但是其中T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞的比例可能不一样。

因此PBMC电转不能像对待一个高度均匀的克隆细胞系一样，期望所有的供体都得到完全相同的成果。
已经有PBMC电转的研究也表明，在混合PBMC的不同细胞亚群中进行转染的效果要分开来评价。真正要加以控制的是，在这样的客观生物学差异存在的情况下，尽量减小人为实验误差。

• 第一个要进行标准化的就是样本前处理

1. 从采集血液开始到最后进行PBMC分离完毕的时间都要做好记录。
2. 有的样本采集之后马上进行处理，而其他的样本则是在放置一段时间之后才开始分离，这样以后的实验就不再是同在一个起跑线上进行的了。
3. 使用冻存PBMC的时候也要统一冻存的方法、存储的条件、复苏的方式和复苏后恢复的时间。
4. 研究表明，新鲜PBMC和冻存PBMC都可用于特定的mRNA电转免疫监测实验中，但是这并不能说明两者在没有设计好的情况下可以随便混合比较。
5. 对于要进行长时间积累临床样本的项目来说，更加合理的做法是事先确定好样本处理方案。

• 第二个要进行标准化的就是细胞的数量以及状态

1. 在PBMC电转之前，可以固定记录总细胞数、活率以及目标亚群的比例。

原因就是这样的：假如第一次实验开始时的存活率是95%，而第二次实验只有75%的话，那么最后经过电转之后的结果就很难有直接比较的价值了。

2. 细胞浓度也非常重要。
3. 在电转系统里，细胞的数量发生了变化，这就会影响到每一个细胞所承载的负荷大小，并且还会影响到整个电转环境。所以不能仅仅记载“用的是同一种软件”就完事了，还要保证进入到每个反应体系中所含有的细胞数目以及样品体积尽量相同。

• 第三个要进行标准化的就是载荷的质量

1. DNA、RNA或者RNP本身也属于实验变量。
2. 以质粒为例，浓度、纯度、结构完整性和各个批次的制备过程都会对实验结果产生影响。
3. 另外，不同的载荷剂量会直接对细胞的状态产生影响。
4. 在PBMC相关的研究中，已经发现质粒用量的变化会影响到转基因表达和电转后细胞活力。

所以，在一个实验的效果变得不好之后，并不是只有问一句“设备设置是否有所改变”就够了，还要再问一句“这批次的核酸是不是跟以前的一样””。对于RNP系统来说，要对蛋白质和RNA的质量、比例以及复合的过程进行控制。

• 第四点要进行标准化的就是操作时间

1. 这一点很容易被人忽视，如果一个实验要用电转20个样本的话。

第一个样品被迅速地悬挂在电转缓冲液里，并且很快就完成了电转过程，而第二个二十个样品则是在相同的体系中等待的时间更长一些，两者的表面执行的是同一条SOP，但是真实的条件已经不一样了。
所以PBMC电转流程中哪些环节可以提前结束、哪些环节需要临近电转的时候才去完成都是要明确的。

2. 当样本量很大时，可以用分批处理的方式，使得每一部分细胞从重新悬浮到完成电击的时间尽量一致。

• 第五个要进行标准化的就是电转换之后的恢复

1. 经过电转之后的几个小时就决定了最后可以得到多少可用细胞。

对原代T细胞的研究表明，在不同的恢复培养条件下，电转后存活率、转染效果和细胞功能都会有所不同。
因此，恢复培养基是否事先处于合适的温度下、细胞接种密度是否一样、是否马上添加刺激因子、什么时候第一次更换液体等等都应成为标准流程中的一部分。如果每次都要由实验人员根据自己的经验来处理这些条件的话，那么PBMC电转批次间的波动就很难得到真正的解决。

• 第六个要进行标准化的就是结果评价

如果实验A是在电转之后六个小时进行检测的，而实验B则是二十四小时之后才做检测的话，在同样的电转条件下做出来的两个结果是不能直接相加或者相减来得出结论的。所以每一个载荷都要有一个固定的检测窗口来定义，但是不能仅仅记录阳性的比例。

1. 一个好的PBMC电转数据体系应该包含以下内容：电转前活率、电转后活率、目标细胞亚群比例、目标表达或编辑结果以及必要的功能指标。

经过长时间的累积之后，这些数据可以为实验室提供关于差异是由于供者的因素还是因为实验过程中的问题的信息。

2. PBMC电转真正达到稳定的程度，并非由于找到某个“最优电压”。

更重要的就是建立起一套完整的标准体系：把细胞来源、前处理、计数、载荷准备、电转操作、恢复培养以及检测的时间都尽量做到可以追溯。

参数决定了一个实验是否能取得成功，而标准化的流程则决定了该次的成功能否被再次复制。