在CRISPR基因编辑实验中，sgRNA的设计、Cas蛋白的选择和靶点的确立都非常重要，但是对许多实际的操作人员而言，真正影响实验推进速度的是后面递送环节。尤其在原代细胞、干细胞、免疫细胞以及其它难以转化的细胞中，常常会出现这样一种现象：CRISPR电转后细胞死亡率高、编辑效率不稳。相同的实验条件，在不同的细胞批号里表现出很大的差别。
当出现上述问题的时候，仅仅提高或者降低电压，并不能够有效地找出问题的原因。CRISPR电转其实就是一个由细胞的状态、递送系统、电击条件、缓冲系统以及恢复培养等几个部分组成的实验流程。

一、第一点是先观察细胞的状态，而不能马上改变电转参数
许多实验人员在观察到CRISPR电转效率降低之后，第一反应就是改变电压。但是，在实际的实验当中，细胞自身的状况往往最容易被人忽略掉的一个因素。比如细胞培养密度、传代次数、消化时间、生长阶段以及培养环境的变化等都会对细胞膜的状态以及电转后恢复的能力产生影响。
如果前一阶段的实验结果是正常的，那么后一阶段的细胞突然大量死亡的情况就比较可疑了。这时我们可以先去查看这两批细胞在培养的状态上有无明显的差别。
对于原代细胞或者很难得到的珍贵样本，最好是尽量保持细胞处理流程的一致性，包括培养密度、收样时间、洗涤过程以及电转前处理的时间等。这样就可以避免由于非电量转换所造成的波动。

二、不同的CRISPR递送方式不可以简单的共享同一个参数
目前CRISPR实验常用的递送方法有质粒DNA、mRNA和Cas蛋白与向导RNA组成RNP复合物等几种。由于分子大小、浓度和所处的缓冲体系不同，所以它们适合的电转条件也会有所不同。比如一个实验室已经建立起了稳定可靠的质粒电转化条件，但是这并不表示把质粒替换为RNP之后就可以直接用原来的参数了。
在创建新的CRISPR电转系统的时候，更加合理的做法是首先确定递送方式，然后再根据电场条件、体系体积、细胞数目以及外源分子浓度等因素来进行系统的优化。

三、电转不是电压越大越好
提高电场强度一般会使得细胞膜的通透性增大，但是当电场强度超过细胞所能承受的最大值时，则有可能造成细胞永久性的损害。所以CRISPR电转优化目标不是找最大的电压，而是找到编辑效率和细胞存活之间的一个平衡点。在做实验的时候可以同时记录两个以上的数据：

1. 第一种就是最后得到的CRISPR编辑效率；
2. 二是电转化之后的细胞存活率。

如果有某个条件可以明显提高编辑率，但是大多数细胞都会死亡的话，在以后的细胞培养以及功能实验中，这样的条件就未必有实际意义了。

四、当发生电弧的时候应该首先检查样本体系
在CRISPR电转的过程中会不时出现异常放电或者电弧的情况。这并不一定表示仪器出现了故障，也不应该简单的认为是电压调得太高了。常见的原因有：

• 缓冲液导电性太强；
• 样品中的盐离子浓度很高；
• 电转体系中有气泡；
• 电极的状态不正常或者样品电阻发生了很大的变化。

因此，如果同一个实验经常出现电弧现象，则应该对缓冲体系、样品制备流程和电转耗材进行重新检查，并不是一直降低电压之后再做实验。
对于重要的样本，在正式进行电转之前可以利用样品电阻等相关信息来辅助判断体系是否出现了明显的异常。

五、电转之后的恢复过程不能被忽略
电脉冲结束并不代表着CRISPR电转实验就结束了。经过电转之后的几分钟到几小时之间就是细胞修复的关键时期。如果细胞长时间处于不适宜培养的电转系统里，或者是恢复培养基、培养密度、温度等等条件都不合理的话，都会对最后得到的细胞状态造成影响。所以在对不同的电转参数进行比较的时候，要尽量保证后面恢复条件的一致性。否则最后所观察到的细胞存活率之间的差别，并不一定是由于电刺激条件造成的。

六、稳定的重复要比一次成功的效率更高
在CRISPR的研究里，并不是每次都能得到高编辑效率就说明整个实验系统就已经成功了。有价值的情况应当在不同的时间段、不同的批次细胞和不同的操作人员中尽量一致。所以建议要建立一个完善的实验记录，其中包括：细胞来源及批次、细胞数目、CRISPR递送方式、核酸或者蛋白质用量、缓冲体系、电击参数、样本电阻、实际脉冲状况、电击之后恢复条件、细胞活力以及最后编辑的结果。
随着数据的不断增加，实验室一般会慢慢找出造成批次之间差异的主要原因。CRISPR电转的本质上并不是一个单一的参数问题，而是一个很多个实验变量一起起作用的结果。如果实验效率不高的话，就不要经常换参数了，把整个实验流程都拆开来，一项一项地去检查细胞的状态、递送系统、电转条件以及恢复过程。许多看上去毫无规律性的实验结果变化，在记录得比较充分之后，通常都可以找出相应的理由来。