在常用的稳定细胞系里，CRISPR递送一般比较容易建立起条件。但是当实验对象由原来的原代细胞、干细胞、免疫细胞等难以转化的细胞变为其他类型的难于转化的细胞时，实验难度就会大大增加。

很多研究者都会遇到两种截然不同的问题。

提高电转强度后，CRISPR编辑效率升高，但是大量的细胞死亡；降低电转强度之后，细胞存活的情况变好了，但是编辑率却降低了。

因此对原代细胞来说，CRISPR电转的主要问题是，并不是单纯的为了提高编辑效率而进行研究，而是要找到编辑效率、细胞存活率以及之后细胞的功能之间的一种平衡点。

为什么原代细胞的优化难度更大呢？

成熟的细胞系在长时间的培养之后，其生长条件趋于稳定。

而原代细胞受到供体来源、分离方法、培养条件、细胞年龄和处理过程的影响很大，在不同的批次之间可能会有明显的差别。

也就是说，在前一版原代细胞里已经验证过的一个在本次样本中的CRISPR电转条件，在下次样本中可能还需要重新确认。

因此原代细胞实验更加要重视标准的操作以及完整的记录。

第一点就是要弄清楚实验所要考察的是哪些指标

在一些基本敲除实验中，研究者们一般会重点考察编辑的比例。

但是如果之后还要做细胞增殖、分化、细胞因子检测、药物处理或其他功能实验的话，仅仅比编辑效率是不够的。

在比较CRISPR电转条件的时候，可以尽量做到以下几点：

编辑效率；

电转之后短期生存率；

细胞恢复速度；

后续增殖状态；

在需要的时候还要去观察和研究有关的目标细胞的功能。

如果某个条件编辑率很高，但是该细胞在接下来几天里仍然不断死亡的话，那么这个条件就不太适合做长时间的研究了。

参数优化最好是用梯度法

当环境不佳的时候，一次修改很多个参数是经常用到的方法。

比如同时调节电压、细胞数目、CRISPR用量以及缓冲液。

尽管下次实验有可能正好成功，但是很难确定是哪个变量起了作用。

更佳的方法就是用分步骤优化的方式。

第一阶段要着重于找到合适电转强度的范围。

在其他的条件尽可能地相同的情况下，用几个梯度来测试，并且把编辑率、细胞活力这两个指标进行比较。

第二阶段对CRISPR系统浓度、细胞数目或体系体积进行优化。

此法在初期的设计上会花费更多的精力，但是建立起之后再做重复实验一般比较容易保持一致。

不同的CRISPR递送方式要分别建立条件

原代细胞CRISPR实验可以用质粒、RNA或者RNP等方式进行递送。

各个不同的系统对于细胞所造成的影响并不是一样的。

比如质粒要被导入到细胞中之后才能实现表达，而RNP则是事先形成的一种蛋白质和RNA组成的复合体，在进入到细胞之后就可以参与到编辑的过程中去了。

所以不同的递送方式所对应的最优电转条件可能会不一样。

在实验过程中不要随便把某一类递送方式下的电转参数直接拷贝到另外一类体系中去。

为什么要去关心实际脉冲以及样品电阻呢？

很多实验记录中只有设置参数的部分。

但是，在实际的电转换过程中，样品本身导电的状态会影响到脉冲的表现。

缓冲液组成、试样量、盐离子残存情况和细胞悬液的状态都会造成不同批次样品电阻值的变化。

在实验条件允许的情况下，记录下真实的脉冲过程和电转之前样品的电阻值，这样就可以给对异常批次进行分析提供更多的证据。

比如某一组细胞编辑率、存活率都出现了明显的降低，而且该组样品的电阻也远远超过了之前实验所用到的范围，那么就可以对样本制备的过程进行进一步的检查了。

电转换之后要恢复到原来的条件下

原代细胞一般要比普通的细胞系更加容易受到伤害。

所以电转之后，恢复的速度也会很容易受制于培养条件。

不同的实验之间要尽可能地保持一致的恢复培养基、培养密度、培养容器以及处理的时间。

否则就是电转参数完全一样，之后细胞的状态也会有很大的不同。

不能直接把文献中的参数用过来

查阅文献对于建立CRISPR电转系统来说是非常重要的一步，但是文献中的参数可以作为起始点，并不是最后的答案。

不同的实验室所用到的细胞来源、培养方法、试剂体系以及操作流程都会有所不同。

特别是原代细胞，虽然名字一样，但是来源、处理方法不同，也可能会有不同的电转耐受性。

所以比较合理的做法是按照文献来确定大概的方向，然后对自身样本做个小规模的检验。

原代细胞CRISPR电转的本质上就是一种平衡的问题。

真正的成熟实验条件，并不是仅仅得到一个漂亮的编辑率就可以的，而是在于经过了编辑之后的细胞仍然有足够的数量、活力以及后续的研究价值。