肝内胆管在成年后形成由大导管和外周小导管组成的层级网络，其形态异质性的调控机制长期未被阐明。本研究通过优化大体积组织透明化与光片成像方法，追踪了肝内胆管从胚胎期到出生后两周的发育进程，发现转录因子Sox9通过抑制Activin A信号通路调控胆管上皮细胞成熟与分支形态发生，决定外周小导管的形成。研究揭示大导管与小导管发育具有不同遗传需求，为理解胆管疾病的形态异常提供了新机制。
 

本研究由Hannah R. Hrncir、Brianna Goodloe、Sergei Bombin、Connor B. Hogan、Othmane Jadi及Adam D. Gracz共同完成，论文题为"Sox9 inhibits Activin A to promote biliary maturation and branching morphogenesis"，发表在Nature Communications。

重要发现
01大体积组织透明化成像方法的建立与应用
传统的肝内胆管研究依赖组织切片或墨水注射造影，前者难以获取三维全局结构，后者可能因管腔内压力改变而干扰发育中的胆管形态。本研究采用iDISCO+组织透明化技术结合光片显微镜，对完整肝脏进行全组织三维成像，实现了对胆管上皮细胞的直接、高灵敏度可视化，无需对胆管管腔进行物理操作。

发育过程中Sox9的缺失导致成年小鼠导管缺乏

EpCAM+IHBD发展的全组织成像

iDISCO+透明化流程包括多梯度甲醇脱水、二氯甲烷脱脂、过氧化氢漂白、再水化与透化、封闭及抗体标记等步骤。研究者以EpCAM作为胆管上皮细胞标志物进行全组织免疫荧光标记，使整个肝内胆管网络在透明化肝脏中得以完整呈现。成像数据经三维重建软件处理后，可进行胆管长度、体积、分支密度等定量分析，并引入Sholl分析方法——原本用于神经元分支复杂度定量的技术——以肝门为起点，以每微米为步长的同心三维球体测量分支交点数，从而实现对胆管分支形态的全局、定量评估。

02Sox9对胆管分支形态发生的调控作用
研究者在肝母细胞中条件性敲除Sox9，并对成年小鼠肝脏进行全组织成像。结果表明，Sox9缺失小鼠的大导管数量和形态与对照无显著差异，但外周小导管呈现紊乱、不连续的状态，数量显著减少。定量分析显示，Sox9缺失小鼠肝内胆管的整体长度呈下降趋势，分支交点数在近端和远端区域均显著降低。这一发现表明，Sox9是外周小导管发育前体形成所必需的因子，而大导管的形态发生则不依赖Sox9，二者具有截然不同的遗传调控需求。 

Sox9调控肝内胆管发育过程中的分支形态发生

激活素A抑制出生后发育过程中肝内胆管的分支形态发生

发育时间进程分析进一步揭示，Sox9缺失小鼠在胚胎期第17.5天之前肝内胆管形态与对照无显著差异，分支复杂度、胆管长度和体积均未出现明显改变。异常最早出现在出生后早期，表现为网状导管结构的缺失和分支密度的全面下降。这说明Sox9并不参与初始的胆管特化过程，而是在出生后阶段调控分支形态发生与胆管成熟。

03Sox9通过抑制Activin A促进胆管成熟
分子机制研究发现，Sox9缺失的胆管上皮细胞未能正常成熟，表现为发育相关基因持续表达，同时TGF-β信号通路活性升高，Activin A表达上调。在野生型胆管上皮细胞类器官中，外源性添加Activin A足以诱导发育基因表达并产生形态缺陷，模拟了Sox9缺失的表型。

 Sox9 促进胆管上皮细胞的胆管身份并限制其转化生长因子-β信号通路 

为验证Activin A升高是否是Sox9缺失导致胆管形态异常的关键介质，研究者在Sox9缺失小鼠出生后第1天和第3天给予Activin A中和抗体进行体内干预。光片成像结果显示，Activin A抑制使Sox9缺失小鼠肝门区域出现了清晰的网状小导管网络，而对照抗体处理组则缺乏该结构。Sholl分析证实，Activin A中和抗体显著增加了肝门附近的胆管分支交点数，近端区域的曲线下面积明显升高。这一结果直接证明，Sox9对Activin A的抑制是促进胆管分支形态发生的核心机制，出生后早期抑制Activin A可部分挽救Sox9缺失导致的胆管形态缺陷。

创新与亮点
本研究突破了传统胆管成像中切片二维观察与墨水注射可能干扰发育形态的局限，建立了基于iDISCO+组织透明化与光片显微镜的大体积三维成像方案，可在完整肝脏中直接呈现整个胆管上皮网络，无需物理操作管腔。该方法结合Sholl定量分析，实现了胆管分支从肝门到外周的全局定量评估，首次清晰揭示了肝内胆管从胚胎期均质网状结构到出生后层级化成熟的完整时空进程。

在光学生物医疗领域，这一策略的价值体现在：发育生物学中可在器官水平追踪管状网络的三维形态发生，避免人为干扰；肝脏疾病研究中，全组织胆管成像可为胆管减少症等疾病提供全局形态学视角，发现传统切片易遗漏的外周异常；组织工程中可评估工程化胆管网络的连通性与成熟度。将神经元分支分析迁移至胆管系统的定量策略，也为其他管状器官网络研究提供了可借鉴的框架。

总结与展望
本研究通过大体积组织透明化与光片成像，揭示了Sox9通过抑制Activin A调控出生后胆管分支形态发生的机制，阐明了大导管与小导管发育的不同遗传需求。未来，该成像方法可进一步拓展至人类肝脏样本，为胆管疾病的病理机制研究和治疗靶点验证提供更精准的三维形态学依据，同时也为其他实体器官中管状网络的发育与疾病研究提供通用的技术路径。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Hrncir, H.R., Goodloe, B., Bombin, S. et al. Sox9 inhibits Activin A to promote biliary maturation and branching morphogenesis. Nat Commun 16, 1667 (2025). 

doi:https://doi.org/10.1038/s41467-025-56813-x