肺炎是全球最常见的感染性疾病之一，其急性发作与复杂病因对儿童、老人等免疫低下人群威胁尤为突出。现有诊断手段如胸部X线、CT、肺部超声及磁共振成像等，受限于空间分辨率不足、电离辐射暴露及早期检出率低，难以实现精准的早期诊断。本研究从疾病全景出发，通过系统的生物信息学分析锁定中性粒细胞弹性蛋白酶为肺炎进展的关键生物标志物，进而设计合成可被该酶特异性激活的近红外荧光探针，并进一步优化为兼具亲水性与肾清除特性的主动靶向响应探针，实现肺部原位实时成像与尿液无创检测的双模态诊断。该探针在感染后极早期即可检出肺损伤，同时可用于药物筛选、剂量优化及炎症机制探究，为肺炎的精准诊疗提供了新工具。

本研究由 Zhen Li、Tong Li、Keyang Li、Maochao Zheng、Lili Chen、Jialong Sun、Yanhui Li、Shasha He、Huayu Tian 共同完成，通讯作者为 Shasha He 与 Huayu Tian。论文题为 "Disease landscape–guided design of neutrophil-specific reporters for early and accurate pneumonia detection in vivo and in urine"，于2026年7月发表于《Science Advances》。

重要发现
01生物标志物的筛选与验证
研究首先对肺炎患者与健康对照的全血基因表达谱进行差异分析，识别出120个显著上调基因和44个下调基因，排名前十的枢纽基因均与中性粒细胞活化密切相关，涉及抗菌活性、细胞迁移、信号传导及炎症调控等过程。基因本体富集分析将这些上调基因关联至嗜天青颗粒、脂多糖结合及Wnt信号通路等免疫功能；通路分析则指向中性粒细胞胞外诱捕网的形成。蛋白质相互作用网络进一步凸显了ELANE等基因在中性粒细胞功能与先天免疫应答中的核心地位。

在单细胞层面，脂多糖诱导小鼠肺部炎症的测序数据显示，刺激后中性粒细胞占支气管肺泡灌洗液细胞总数的77%，肺泡巨噬细胞占18%，配体-受体分析揭示了中性粒细胞与其他免疫细胞间的广泛通讯。在急性肺损伤模型中，损伤肺组织的ELANE表达较对照上调14倍，髓过氧化物酶上调24倍，差异基因显著富集于中性粒细胞活化、趋化及脂多糖应答等过程，并涉及IL-17信号、TNF信号等炎症通路。这些结果共同确立了中性粒细胞在肺炎发病中的核心效应地位，并将中性粒细胞弹性蛋白酶确定为疾病进展的关键生物标志物。

急性肺损伤模型的构建与鉴定

在脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠中，CT成像显示注射后12至24小时肺密度增加、含气量减少、渗出物替代空气。髓过氧化物酶表达在3、6、12、24小时分别为对照的2.5、4.1、6.0、4.3倍，弹性蛋白酶表达分别为对照的1.1、1.2、1.3、1.2倍。流式细胞术显示中性粒细胞及弹性蛋白酶阳性细胞在注射后12小时达峰，且早在3小时即可观察到升高。线性回归分析显示，肺内弹性蛋白酶阳性细胞比例与肺损伤评分及肺组织TNF-α 水平均呈正相关，进一步验证了该酶作为肺损伤检测标志物的潜力。

02探针设计与体外光学性能
基于上述发现，研究设计了可激活的中性粒细胞弹性蛋白酶响应探针。该探针以半花菁荧光团CyOH为信号单元，通过对氨基苄醇连接臂与可被弹性蛋白酶特异性切割的肽底物N-乙酰-丙氨酰-脯氨酰-缬氨酸偶联。探针初始在608纳米和655纳米处有两个特征吸收峰且无荧光；酶切后释放CyOH，680纳米处出现新吸收峰，710纳米处荧光信号增强10倍。色谱分析证实了探针在酶作用下转化为游离CyOH，酶促动力学测得米氏常数为167.1微摩尔，催化效率为1.67×10⁻⁴微摩尔⁻¹ 秒⁻¹。

中性弹性蛋白酶（NE）对中性弹性蛋白酶响应探针（NERP）的响应性

特异性验证表明，探针在与肺炎微环境中可能存在的其他酶或活性氧物种孵育时荧光变化可忽略。在骨髓来源中性粒细胞中，探针的荧光激活程度与游离CyOH相当，信号较巨噬细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞白血病细胞、T细胞及肺上皮细胞等非靶细胞高出3至7倍；弹性蛋白酶抑制剂西维来司他可显著抑制激活。这些数据确认了探针对弹性蛋白酶的特异性响应及其在中性粒细胞内的完全激活。

03亲水性探针的体内成像与尿液检测
为适配体内应用，研究通过铜催化叠氮-炔环加成反应将分子量2000的聚乙二醇连接至探针侧链，获得亲水性主动靶向响应探针。聚乙二醇的引入不影响酶响应性与生物安全性，但显著提升水溶性，便于气管内给药和经肾快速排泄。健康小鼠药代动力学显示血浆浓度在注射后180分钟回到基线，消除半衰期90分钟，24小时肾清除效率达60%。排泄至尿液中的探针在色谱中保留时间与缓冲液中一致，质谱显示平均分子量约2872道尔顿，证实其在肾清除过程中结构稳定，适用于尿液分析。

\(ATRPH\)检测ALI

在不同感染时长的急性肺损伤模型中，气管内给药后2分钟内即可在肺部观察到近红外荧光信号增强，12小时和24小时损伤组腹侧肺部信号分别为健康对照的4.7倍和8.5倍，背侧肺部分别为8.3倍和5.9倍，信号在45至60分钟达峰。膀胱在注射后10分钟即可显影，亮度渐增至60分钟。该探针最早可在感染后3小时检出肺损伤，此时膀胱信号已较健康对照高1.6倍。缺失酶响应肽段的阴性对照探针在损伤组和健康组均无明显信号；预先给予高浓度酶抑制剂的损伤组信号亦与健康组一致，证实了体内激活的特异性。

尿液检测方面，给药后12小时尿液中，感染1.5、3、6、12、24小时组的荧光信号分别为健康组的0.8、6.5、6.9、15.6、5.5倍；24小时尿液中对应倍数分别为1.1、5.0、6.7、25.2、8.4倍。尿液检测最早可在感染后3小时检出肺损伤，早期灵敏度优于CT、酶联免疫吸附实验细胞因子检测及组织病理染色。为排除其他器官炎症干扰，研究建立了顺铂诱导急性肾损伤和酒精诱导急性肝损伤模型，非肺部炎症组的肺部、膀胱及尿液荧光信号与健康组无显著差异，即使肝肾合并肺损伤组中肾脏信号也未升高，证明尿液检测对肺部炎症具有高度特异性。

ATRP 探针对其他肺部疾病的检测

准确性评估显示，肺组织弹性蛋白酶阳性细胞比例与肺部荧光信号及尿液荧光信号均呈正相关。主成分分析可清晰区分健康与损伤小鼠。受试者工作特征曲线分析显示，肺部、膀胱及12小时尿液荧光信号的曲线下面积分别为0.87、0.69和0.99。在模拟临床样本的人工血浆和尿液中，探针对弹性蛋白酶的检测限分别为107毫单位/升和148毫单位/升，低于已报道肺炎患者血浆和尿液中的酶水平，支持其在临床可及体液中无创检测的潜力。

创新与亮点

本研究的核心突破在于解决了肺炎早期诊断中特异性不足与组织穿透受限两大难题。传统影像学难以在疾病早期检出分子层面异常，现有分子探针多为单一模式且荧光穿透深度有限。研究从疾病全景的生物信息学分析出发，精准锁定中性粒细胞弹性蛋白酶，设计了可被该酶特异性激活的近红外荧光探针，并通过聚乙二醇修饰赋予肾清除特性，首创性地实现肺部原位实时成像与尿液无创检测的双模态诊断。该技术在感染后3小时即可检出肺损伤，尿液检测曲线下面积达0.99，显著早于CT、免疫检测和组织病理等常规方法。在光学生物医疗领域，这一策略不仅为肺炎提供了无辐射、无创、高灵敏度的早期诊断工具，还可拓展至药物筛选、剂量优化和炎症通路机制研究，对其他中性粒细胞驱动的急性炎症性肺病具有广泛应用潜力。

总结与展望

本研究以疾病全景引导的生物标志物筛选为起点，确立中性粒细胞弹性蛋白酶为肺炎关键靶点，设计合成可激活的近红外荧光探针并优化为多种给药剂型，实现肺部原位成像与尿液无创检测的双模态早期诊断，同时展示了在药物评估和机制探究中的实用价值。未来需进一步优化粒径与配方以贴近临床雾化或干粉吸入给药，寻找临床获批的酶响应基团与荧光团并在大动物模型中验证生物相容性，建立体液检测的量化标准与炎症程度的关联体系，开发近红外二区、磁共振及CT等多模态探针以提升精度与灵敏度，从而推动该技术向临床转化。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。

Zhen Li et al. ,Disease landscape–guided design of neutrophil-specific reporters for early and accurate pneumonia detection in vivo and in urine.Sci. Adv.12,eaeb4417(2026).

doi:DOI:10.1126/sciadv.aeb4417