蛋白上样总被稀释?试试 5× 浓缩上样缓冲液解决低丰度样本难题
一、什么是 5× 蛋白上样缓冲液?
上样缓冲液(5 ×)为 SDSPAGE 变性电泳专用浓缩预混试剂,内含 TrisHCl 缓冲体系、SDS 变性剂、还原剂、甘油与溴酚蓝指示剂。按照 1:4 体积比例与蛋白样品混合稀释为 1× 工作浓度;经高温煮沸处理,SDS 破坏蛋白高级结构,还原剂打开二硫键,使蛋白带上均匀负电荷;甘油提升样品比重防止扩散,溴酚蓝用于直观监控电泳进程。上样缓冲液(5 ×)体积占用小,可以容纳更多蛋白样本,适配蛋白制样前处理。
二、和 1× 上样缓冲液相比具备哪些技术差异?
1× 上样缓冲液为即用型,直接加入样品即可,但会大幅稀释蛋白,不利于低丰度样本检测。上样缓冲液(5 ×)仅需要小体积即可完成制样,蛋白被稀释程度低,单位孔道可上样更多蛋白,适合低表达蛋白样本。缺点是必须严格遵守 1:4 配比,配比错误会造成 SDS、还原剂浓度异常,引发蛋白迁移偏移。低温储存会出现 SDS 析出,使用前需要回温完全溶解,不可直接取用析出液体进行实验。
三、5× 上样缓冲液适用于哪些科研实验?
上样缓冲液(5 ×)仅适合
变性还原 SDSPAGE,不可用于非变性电泳,仅限科学研究,不能用于临床诊断。广泛用于细胞、组织蛋白样本制样,后续开展 Western Blot 免疫印迹;也可用于重组蛋白纯度检测、蛋白分子量鉴定。样品混合后沸水浴加热 35 min,冷却离心取上清上样;长期20℃分装保存,减少反复冻融。配比、加热条件需要严格控制,避免条带拖尾、迁移异常等电泳问题。
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