双抗体PLA新方法在R-loop(RNA–DNA 杂交体)测试中的优势
2026-09-02 来源:本站 点击次数:55
图1：R-PLA 原理示意（引自 Sanchez et al., Cell Reports Methods 6, 101380, 2026，Graphical abstract）
R-loop（RNA–DNA 杂交体）是近些年基因组稳定性研究绕不开的热点：它参与转录调控、DNA 损伤修复、复制应激和天然免疫应答，一旦失控又与基因组不稳定、肿瘤发生直接相关。想研究它，第一步就是把它「测得到、测得准」。
一、现有方法的两块短板
S9.6 单抗免疫荧光（IF）和突变型 RNaseH1（mutRNaseH1）过表达，是目前显微镜下测 R-loop 的两类主流手段，但各有局限。
（1）S9.6 IF：S9.6 识别 RNA–DNA 杂交体结构，但在 IF 中对其他 RNA 结构也有亲和，信号弥散、背景强，胞质里大量着色，难以做精细共定位。
（2）mutRNaseH1 过表达：需要转染外源质粒，且过表达可能「锁住」R-loop，妨碍其被内源 RNaseH1 正常加工，干扰结果解读。
二、R-PLA：两个抗体邻近，才有信号
2026 年 5 月，Emory 大学 Kyle M. Miller 团队在《Cell Reports Methods》发表 R-PLA 方法，利用邻近连接技术（PLA）把 S9.6 与内源 RNaseH1 双抗体组合起来。
只有当 S9.6 和 RNaseH1 同时结合到同一条 R-loop 上、且彼此足够靠近时，PLA 探针才能连接并滚环放大，形成可计数的荧光点（foci）。双抗体构成双保险，放大反应进一步拉高灵敏度。
三、结果
（一）特异性与灵敏度验证
单独用任一抗体几乎无背景信号，只有双抗体组合才出现 R-PLA 焦点；siRNA 敲低内源 RNaseH1 后信号消失；用重组 RNaseH1 酶消化 R-loop 后信号同样消失，而 RNase III、RNase T1（分别消化 dsRNA、ssRNA）处理均无影响——证明检测的确实是 R-loop，而非其他 RNA 结构（图2B）。
R-PLA 信号呈离散 foci，通过 ImageJ analyze particles直接定量；与 S9.6 IF、mutRNaseH1 相比，R-PLA 把核质区信号占比提高到约 67%，胞质杂散信号被明显压下去（图2D）。
图2：R-PLA 特异性验证与定量（引自 Sanchez et al., Cell Reports Methods 6, 101380, 2026，Figure 1）
（二）药物诱导与转录依赖性
BET 抑制剂 JQ1、PARP 抑制剂 olaparib 处理 U2OS 细胞 18 h，R-PLA 焦点数显著上升；RNA Pol II 转录抑制剂 DRB 处理后信号回落——说明 R-PLA 信号是转录依赖性的（图3A）。
在三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 中重复验证，olaparib 同样诱导 R-loop，说明方法不限于单一细胞系（图3B）。
（三）DNA 损伤位点的 R-loop 成像
5 Gy 电离辐射（IR）后 2 h，核内 R-PLA 信号显著增加，且可被 RNaseH1 消化清除、不被 RNase III/T1 清除（图3C）。RNaseH1–γH2AX 双抗 PLA 显示，IR 后 DNA 双链断裂（DSB）附近的 R-loop 显著增多（图3D）。
在 Fok1 定点切割的 U2OS 263 报告系统中，用 ATM 抑制剂或 JQ1 解除断裂位点附近的转录抑制后，R-PLA 信号与断裂位点清晰共定位（图3F）。对照实验里，S9.6 IF 背景过高无法定量（图3G），RNaseH1 IF 灵敏度不足（图3H）
图3：DNA 损伤位点的 R-loop 检测（引自 Sanchez et al., Cell Reports Methods 6, 101380, 2026，Figure 2）
（四）端粒与复制叉等特定基因组位点
在 TRF1-Fok1 诱导的受损端粒上，R-PLA 焦点与端粒共定位；敲低 ALT 端粒维持相关因子 CHD4 或 TRIM24 后，端粒 R-loop 显著增多（图4A）。
在 BLOCK-ID 复制叉阻滞系统中，R-PLA 信号与阻滞位点共定位，olaparib 处理后进一步升高（图4B）。
（五）跨物种与流式高通量
小鼠 E0771.lmb.GP 细胞中，olaparib 诱导的 R-loop 同样能被 R-PLA 灵敏检出（图4C），人、鼠通用。
在流式体系中，S9.6、RNaseH1 单抗体几乎无法产生阳性信号，而 R-PLA 能稳定区分 R-loop 阳性细胞比例；olaparib 处理后阳性比例显著上升（图4D、4E），为悬浮细胞、高通量筛选提供了可能。
图4：端粒、复制叉、小鼠细胞及流式检测（引自 Sanchez et al., Cell Reports Methods 6, 101380, 2026，Figure 3）
四、小结：方法亮点
特异性：双抗体邻近触发信号，天然过滤单一抗体的非特异背景；
灵敏度：基于滚环扩增，实现信号千倍放大，弱信号也能被看到；
易定量：信号呈 foci，配合 ImageJ 数点，也支持流式高通量；
对做 DNA 损伤修复、转录调控、复制应激、肿瘤基因组学方向的课题组来说，R-PLA 是一个上手快、可复现的 R-loop 可视化新选择。
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货号 |
产品名称 |
描述 |
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适用于细胞样本，鼠兔一抗，带有Red/Atto647荧光基团 |
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NaveniFlex Cell MR Atto647N |
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适用于组织样本，鼠兔一抗，带有Red/Atto647荧光基团 |
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适用于细胞，组织样本，鼠兔一抗明场下检测 |
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Naveni Detect + Interact |
用于细胞样本，兼容鼠兔一抗。 |
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RNase H1 (F9X8G) Rabbit Monoclonal Antibody |
应用：WB、IP、IF |
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RNeasy Mini Kit |
细胞、组织RNA提取试剂盒 |
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Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Recombinant Rabbit mAb (S-1368-15) |
应用：IHC-P 、WB、IP |
相关文献
1、Sanchez A, Perren JO, Aiello M, Buchwald ZS, Miller KM. R-PLA enables enhanced detection of R-loops in mammalian cells using proximity ligation. Cell Reports Methods 6, 101380 (2026). DOI: 10.1016/j.crmeth.2026.101380
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