无细胞抗体表达与SpyBLI结合动力学检测技术的介绍与应用
2026-09-09 来源:本站 点击次数:47摘要：本文介绍 SpyBLI 结合动力学检测技术与 eProtein Discovery 无细胞系统，讲解抗体快速验证方案。
关键词：无细胞系统、无细胞表达、无细胞抗体表达、eProtein Discovery、AI 蛋白设计、抗体工程、纳米抗体、BLI、SPR、NGS、结合动力学
剑桥大学 RSC Chemical Biology 论文揭示抗体工程“验证”环节的新范式——eProtein Discovery 无细胞表达 × SpyBLI 共价捕获，无需纯化、无需测浓度，直接从未纯化样品读取 KD、kon、koff。
设计的瓶颈，从来不在设计，而在验证
抗体工程与蛋白设计的节奏，正在被 AI 与下一代测序（NGS）改写。如今，一轮计算设计、一次噬菌体展示或酵母展示库的高通量测序，动辄就能产出几十甚至上百个候选结合蛋白。真正拖慢研发进程的，往往是紧随其后的验证环节——为了给每一个候选测一个准确的结合动力学（平衡解离常数 KD、结合速率 kon、解离速率 koff），传统的 SPR/BLI 流程要求把每个分子都纯化出来、测定浓度、再做精密的配体固定。一个分子动辄耗费数天到数周，成了压在研发周期上的一块隐形天花板。
设计可以一天迭代几百次，验证却要等上几周——这个错位，正是当下抗体与结合蛋白工程的真实痛点。
剑桥大学的答案：SpyBLI
针对这一瓶颈，剑桥大学 PietroSormanni 团队在国际期刊 RSC Chemical Biology 上发表了一种名为 SpyBLI 的新方法，用一个“共价捕获”的巧思，把整套流程大幅简化。
方法的灵感来自 SpyCatcher003–SpyTag003 这对“分子胶水”——它们能通过异肽键实现快速、特异且不可逆的共价连接。SpyBLI 正是借助这一特性，把带有 SpyTag 标签的结合蛋白定向、均匀地捕获到 BLI 生物传感器上，从而一举解决了传统方法的三大难题：
- 无需纯化：直接从未纯化的哺乳细胞上清、或无细胞表达混合液中读数，省去层析纯化的漫长流程；
- 无需测浓度：共价捕获天然绕开了“粗样品中配体浓度未知”这一经典难题，不再需要额外的定量实验；
- 定向固定：所有分子统一朝向排列，告别随机取向带来的表面异质性与传质假象，数据质量大幅提升。
图1.SpyBLI 工作流程总览。(A)目标结合物由线性基因片段编码，这些片段可直接用于无细胞表达，或通过金门克隆法插入载体，在哺乳动物细胞培养液中进行表达。(B)单个检测传感器完整 BLI 实验体系总览，标注全部实验步骤（见图例）。(C)满载后的 BLI 检测传感器示意图，形成取向相近、分布均一的结合物表面。(D)单循环动力学结合曲线示例（蓝色）：传感器在多步结合阶段探测梯度升高的抗原浓度得到该曲线。采用结合模型对曲线拟合（黑色曲线），解算动力学速率常数（结合速率 kon、解离速率 koff）以及平衡解离常数（KD=koff/kon）。
eProtein Discovery：让造蛋白的速度跟上测蛋白的速度
一套方法能否真正落地，关键还在于能否稳定、快速地造出这些结合蛋白。这正是 Nuclera eProtein Discovery 无细胞系统（点击查看）大显身手的地方。
论文团队面临的是一类棘手的目标：部分纳米抗体含有非经典二硫键，它们对 CDR3 构象的稳定十分关键，但大肠杆菌无细胞体系偏还原的胞质环境会阻碍二硫键的正确形成。团队利用 eProtein Discovery 系统，在 24 小时内并行筛选了 24 个构建体×8 种无细胞反应体系（共 192 种条件），系统性地比较可溶性标签与各类氧化还原等添加剂（PDI、GSSG、TrxB1、DnaK 分子伴侣组合等）的组合效果，从而锁定理想表达条件——去除可溶性标签、强化氧化还原环境，明显提升了所有测试蛋白的可溶产量。12 个抗体片段随后被成功表达纯化，并经质谱确认二硫键正确形成。
正是这一步“自动化高通量的蛋白表达条件优化”，让“从线性基因片段到可直接用于动力学测量的蛋白”变得可靠、快速且几乎零手工操作。
图2.eProtein Discovery 系统利用数字微流控 Cartridge 同时支持 24 种 DNA 构建体与 8 组无细胞反应体系进行全自动组合筛选，单次实验可生成 192 组表达数据，24 小时内完成蛋白表达检测与初步纯化分析，48 小时即可获得用于下游实验的活性蛋白。
硬核数据：跨度六个数量级，结果跨体系保持一致
用这套方法，团队验证了它惊人的适用范围与稳健性：
| 指标 | 结果 |
|---|---|
| 亲和力跨度 | 6 个数量级——从高 nM（Nb.B201 结合 HSA，KD≈772nM）到低 pM（IxekizumabscFv 结合 IL-17A，KD≈3pM） |
| 三种来源一致性 | 纯化样品、哺乳细胞上清、无细胞表达三种来源测得的 KD 高度吻合 |
| 速度 | 从收到基因片段到拿到动力学数据<24 小时 |
| 样品需求 | 仅需 10 µL 无细胞反应混合物 |
| 二硫键难题 | 含非经典二硫键的纳米抗体成功正确折叠 |
| 对比传统 | 哺乳表达需克隆+转染+表达，约 10 天 |
表1.SpyBLI 联合无细胞表达系统的性能验证结果
更关键的是，无细胞表达的抗体片段，其测得的结合动力学与哺乳细胞表达、甚至与经亲和层析+分子排阻纯化的样品完全可比。这意味着，eProtein Discovery 系统提供的无细胞产物，在能否用于高精度动力学表这一严苛的判据上，经得起检验。
谁更需要这套工作流？
- 计算蛋白设计/AI 抗体设计团队——获得快速、准确的实验反馈，让“设计-测试-优化”迭代真正转起来；
- NGS 抗体库与展示库筛选——对成百上千的测序命中候选进行高通量动力学初筛，快速锁定高亲和力分子；
- 双抗/多特异性抗体早期开发——在投入昂贵纯化之前，先完成候选的亲和力与动力学排序；
- 含二硫键纳米抗体/单链抗体的表征——攻克氧化还原依赖型分子的表达与折叠难题。
结语：把验证也提速到天级
当设计被 AI 加速到小时级，验证也必须跟上节奏。SpyBLI 与 eProtein Discovery 的组合，把过去“克隆—表达—纯化—测动力学”这条耗时数周的长流程，压缩成了一个天级循环——没有克隆、没有 PCR、没有纯化、没有浓度测定。对于任何想在抗体工程与结合蛋白研发赛道上跑得更快的团队，这都是一套值得立刻放进工具箱的答案。
参考文献
Predeina O, Atkinson M, Wissett O, et al. The SpyBLI cell-free pipeline for the rapid quantification of binding kinetics from crude samples. RSC Chemical Biology, 2025, 6, 1313–1327. DOI: 10.1039/d5cb00079c
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本文由上海曼博生物基于公开学术文献整理，仅用于科研信息分享，不构成产品性能承诺或实验方案推荐，具体实验参数与应用效果请结合实际研究体系验证。上海曼博生物可提供 nuclera eProtein Discovery 无细胞蛋白表达筛选系统及相关技术支持（点击查看），适配 AI 蛋白设计、抗体工程、结合蛋白研发等多种科研场景，曼博生物可为相关实验提供产品咨询与方案参考。