摘要：借助数字微流控无细胞蛋白合成系统，高通量筛选明确植物球蛋白表达与稳定性的关键决定因子

关键词：无细胞蛋白合成、无细胞蛋白表达、数字微流控、植物球蛋白、高通量筛选、难表达蛋白、膜蛋白、蛋白稳定性、可溶性标签、半胱氨酸突变、血红素蛋白

一、植物球蛋白无细胞表达研究简述
1.1 本文摘要
血红素蛋白参与机体代谢与应激应答，但存在细胞毒性、折叠困难、传统活细胞表达产量低、通用方案无法跨物种复用，植物球蛋白（Pgbs）就是典型代表。本文利用数字微流控无细胞蛋白合成（DMF-CFPS）技术高通量并行筛选可溶性标签、氧化还原添加剂、半胱氨酸突变为丙氨酸三大变量，明确调控植物球蛋白无细胞蛋白表达与蛋白稳定性的关键决定因子。本研究选取两种优势突变体进行放大表达，成功获得可溶性脱辅基球蛋白。研究结果证实，无细胞蛋白合成（CFPS）（可点击查看）技术可快速、平行筛选蛋白理想表达条件，同时阐明保守半胱氨酸、氧化还原环境在植物球蛋白合成成熟过程中的作用。

1.2 研究对象
● 甜菜1型植物球蛋白野生型BvPgb 1.2及保守半胱氨酸突变体C86A；
● 全新鉴定8个燕麦植物球蛋白AsPgb，分3个同源组：1型两组（AsPgb1.1–1.3、AsPgb1.4–1.6）、3型一组（AsPgb3.1–3.2）；3组定点突变体：AsPgb1.1-C70A、AsPgb1.5-C84A、AsPgb3.1-C161A（保守C→A替换）；

二、传统蛋白表达体系局限与CFPS应用研究背景
2.1. 血红素/植物球蛋白表达瓶颈
植物球蛋白（Pgbs）参与NO清除、氧化应激调控，属于典型难表达血红素蛋白：脱辅基球蛋白易聚集、血红素对宿主细胞有毒、合成与血红素插入难以同步；针对一种Pgbs优化的表达条件无法直接套用至同源蛋白，传统体内表达需要数周试错，通量低。

2.2 保守半胱氨酸的未知作用
Pgbs序列高度保守半胱氨酸残基，易形成错配二硫键、引发氧化聚集；C突变为A可消除巯基，但该突变对不同Pgbs表达量、可溶性、热稳定性的影响缺乏系统对比。

2.3 传统筛选局限性
活细胞筛选受转化效率、细胞毒性限制；常规96孔CFPS体系试剂消耗大、条件并行数量少；数字微流控（电润湿操控纳升级液滴）实现全自动高通量并行筛选，48小时内可完成192组表达条件测试，大幅缩短优化周期。

三、实验方法（DMF-CFPS完整解决方案）
3.1 数字微流控卡盒工作原理
nuclera eProtein Discovery系统配套专用卡盒依托介电上电润湿实现纳升级液滴独立移动、混合、孵育、磁珠纯化；卡盒集成多试剂储液孔，可自动完成CFPS合成、BiFC荧光定量、链霉亲和素磁珠原位纯化整套流程；通过双分子荧光互补BiFC实时定量蛋白表达浓度。

3.2 eGene线性DNA模板构建
利用Nuclera eGene可溶性标签试剂盒PCR组装得到整套eGene线性表达模板。线性模板两端分别携带：
● N端：7种可溶性标签（P17/CUSF/FH8/TRX/SUMO/ZZ/SNUT）或无标签+3C蛋白酶酶切位点；

● C端：TEV酶切位点+GFP检测标签+Strep纯化标签；

图1 eGene模板结构示意图

采用一步式PCR批量构建所有野生型与C→A突变eGene构建体，包含BvPgb 1.2、C86A、AsPgb 1.1、C70A、AsPgb 1.5、C84A、AsPgb 3.1、C161A。归一化浓度后进行卡盒上样。

3.3 配置无细胞反应液（CFB）
制备8组无细胞反应体系（CFB），每体系含无细胞核心试剂、定制氯化血红素补充液（用于辅因子插入测试）和不同功能的添加剂（标准缓冲液、PDI+GSSG、GSSG、TRXB1、DnaK分子伴侣混合液、金属辅因子混合液、Zn²⁺、3C蛋白酶），加样至卡盒对应孔。

3.4 两种卡盒筛选
● 3×8（甜菜BvPgb筛选）：2种蛋白（WT/C86A）×（7种可溶性标签+无标签）×8组CFB，共128组条件；

● 6×4（燕麦AsPgb筛选）：6种蛋白（3WT+3突变）×（3种可溶性小标签+无标签）×8组CFB，共192组条件；

启动可溶性蛋白筛选程序，自动筛选每组蛋白产量较高的组合（3×8选10组，6×4选5组）共30组，进行原位磁珠纯化，从而输出蛋白表达与纯化产量图谱。

图2 用于无细胞蛋白合成（CFPS）的数字微流控卡盒

3.5 放大与蛋白表征
● 200 μL体系无细胞放大表达，Strep亲和纯化，SDS-PAGE验证；
● 质谱光度MP：测定蛋白寡聚状态；
● 纳米差示扫描荧光nanoDSF：测定蛋白熔解温度Tm，评估热稳定性。

3.6 生物信息前期工作
● 燕麦全基因组BLAST挖掘8个全新AsPgb，完成组织表达谱（根、叶、种子、颖壳等）；
● ColabFold预测AsPgb三维结构，UCSF ChimeraX与已解析BvPgb1.2（PDB:7ZOS）骨架比对，RMSD＜1 Å，整体折叠高度同源，但表面电荷、局部疏水存在差异。

四、实验结果
4.1 燕麦AsPgb基因与组织表达特征
1. 8个AsPgb分为3进化同源组，组内序列相似度＞90%；
● OG0017468（AsPgb1.1–1.3）：富集叶片、颖壳，种子表达低；
● OG0007273（AsPgb1.4–1.6）：种子、根高表达，颖壳无转录；
● OG0012302（AsPgb3.1–3.2）：全组织广谱高表达；

2. 所有AsPgb在根系均可检测到转录，与植物球蛋白参与根系氧化应激功能吻合。

表1. 不同同源组燕麦植物球蛋白（AsPgbs）在各组织中的检出情况

注：数值为检出阳性样本数量，n代表该组织总样本数；同源组合计为组内所有蛋白检出总数，分母为该组织最大可检出样本数。

4.2 结构比对结论
AsPgb1.1、1.5与BvPgb1.2主链RMSD仅0.859、0.945 Å，血红素结合口袋、保守半胱氨酸空间位置高度重合；但细微序列差异直接造成体内/体外表达行为完全不同。

表2 燕麦植物球蛋白预测结构与甜菜1型球蛋白标准晶体结构（BvPgb 1.2，PDB编号7ZOS）的叠合比对结果

图3 AsPgb 1.1（橙色）、AsPgb 1.5（粉色）预测结构与BvPgb 1.2（蓝色）主链叠合图

4.3 微流控高通量筛选关键规律
1. 半胱氨酸C→A突变明显改变表达/纯化产率
● BvPgb C86A突变体：荧光表达总量高于野生型，纯化总收率与WT持平；SUMO标签强烈抑制野生型表达，但对C86A几乎无负面影响；

● AsPgb1.1 C70A：纯化收率高于野生；AsPgb1.5 C84A标签依赖性大幅改变；AsPgb3.1 C161A纯化效率大幅提升；

总体：消除保守巯基可减轻氧化聚集，多数Pgbs突变后可溶性、总产率提升，证明保守半胱氨酸是表达稳定性负向决定因子。

2. 氧化还原添加剂是Pgbs表达的关键调控因素
● GSSG（22%）、PDI/GSSG组合（26%）合计占优选反应体系48%，远高于分子伴侣DnaK（2%）、TRXB1（4%）；
● 氧化微环境促进二硫键正确折叠、抑制巯基自发氧化聚集，是Pgbs稳定合成的核心条件；单纯还原型伴侣提升效果微弱；
● 金属辅因子混合液、Zn²⁺次之，可辅助血红素结合口袋折叠。

3. 可溶性标签具有蛋白/突变体特异性，小标签更优
● 表现较优标签集中在10 kDa以内：P17、CUSF、FH8；大标签SUMO/TRX/ZZ/SNUT普遍抑制Pgbs表达；
● 无标签体系占优选条件40%，说明标签并非必需，部分Pgbs去除融合标签后折叠更佳；3C蛋白酶添加组19%被选中，证实标签会阻碍部分Pgbs折叠；
● 物种差异：CUSF较适配BvPgb WT，P17较适配AsPgb1.5。

图4 各蛋白表达产量数据（μM），蓝色块产量＞8 μM，红色块产量＜8 μM

图5 各优选组蛋白表达产量（绿色）、纯化产量（蓝色）和纯化回收率（红色圆点）

4.4 放大表达与蛋白理化表征
1. 条件放大：AsPgb 1.5与BvPgb 1.2序列同源性高，AsPgb 1.5选用P17标签，BvPgb 1.2选用CUSF标签；均采用筛选效果优的PDI/GSSG反应液。放大纯化后获得P17-AsPgb1.5（0.69 mg/mL，22 μM）和CUSF-BvPgb1.2（0.77 mg/mL，20 μM），纯化后条带单一；

2. 质谱光度MP：两种蛋白均以单体为主（BvPgb单体占93%，AsPgb1.5单体72%），获得高纯度可溶性脱辅基apo-Pgb（无血红素结合）；

3. 热稳定性nanoDSF（数据未展示）：未开展完整热力学分析，BvPgb熔解温度Tm=55 ℃，高温易聚集；AsPgb1.5热转变信号不清晰，稳定性弱于甜菜同源蛋白，解释传统方案无法跨物种复用。

图6 P17-AsPgb 1.5（31 kDa）与CUSF-BvPgb 1.2（38 kDa）放大产物及寡聚状态表征

五、总结与展望
本研究依托微流控无细胞蛋白合成（DMF-CFPS）体系，实现了血红素结合球蛋白Pgbs高通量条件筛选，明确保守半胱氨酸易引发蛋白氧化聚集，将其突变为丙氨酸可大幅提升蛋白可溶性与纯化回收率；由氧化型谷胱甘肽GSSG与二硫键异构酶PDI组成的氧化环境更利于Pgbs正确折叠，且小分子亲水融合标签适配性好，大分子量标签会抑制蛋白折叠。不同物种同源Pgbs骨架虽保守，但序列差异导致理化性质与表达条件存在物种特异性，难以共用一套表达方案。

该体系可快速获得稳定可溶的脱辅基apo-Pgb蛋白，弥补了天然蛋白易聚集的短板，但目前尚未完成血红素嵌入及蛋白生物活性验证，突变位点改造维度较为有限。后续可添加GAPDH分子伴侣实现成熟全功能holo-Pgb制备，完善NO清除、抗氧化等功能检测，扩充氨基酸突变类型阐明巯基调控机理，并将这套高通量筛选系统拓展应用于膜蛋白、血红素酶、毒性重组蛋白等各类难表达蛋白的研发与机制解析，为血红素蛋白定向改造与应用开发提供技术支撑。

参考文献
Groth, L.; Bülow, L. Digital Microffuidics-Driven Cell-Free Protein Synthesis Platform Reveals Expression and Stability Determinants for Phytoglobins and Cysteine-to-Alanine Substituted Variants. Antioxidants 2025, 14, 1317.

拓展阅读
Nuclera无细胞蛋白表达筛选系统技术专栏（点击访问曼博生物官网查看）

本文基于Nuclera公开资料由中国抗体蛋白方案提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享、实验参考等。上海曼博生物可提供Nuclera eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统、数字微流控无细胞蛋白合成系统、DMF-CFPS高通量蛋白筛选、eGene可溶性标签试剂盒、难表达蛋白筛选、膜蛋白表达、血红素蛋白表达、蛋白稳定性筛选及蛋白纯化相关产品与技术支持，助力国内科研机构快速开展靶点验证、膜蛋白表达、AI蛋白设计和酶的定向进化以及酶工程等相关研究，如您需要欢迎咨询!