双抗夹心法检测猪ANG-2的完整操作步骤
2026-09-09 来源:本站 点击次数:14
双抗夹心法检测猪ANG-2的完整操作步骤如下：
🧫 实验前准备
提前将所有实验试剂从冰箱取出，室温平衡30分钟，同时预热37℃恒温孵育箱，准备好校准后的移液枪、配套枪头、96孔酶标板等耗材。
1. 抗体包被（预包被试剂盒可跳过）
将猪ANG-2特异性捕获抗体按说明书推荐比例稀释，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，次日用洗涤液洗板3次，拍干后加入封闭液室温封闭1小时，再次洗板拍干备用。
2. 加样操作
设置空白孔、标准品梯度孔、待测样本孔：
标准品孔依次加入不同浓度的猪ANG-2标准品100μL
待测样本孔先加40μL样本稀释液，再加10μL待测猪血清样本，实现5倍稀释
空白孔不加任何样本，其余操作保持一致
加样完成后轻轻晃动酶标板混匀，用封板膜封住孔口，37℃温育60分钟。
3. 洗板操作
弃去孔内所有液体，在吸水纸上充分拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后甩去液体，拍干，重复该洗板步骤5次，也可使用自动洗板机完成操作。
4. 酶标抗体孵育
除空白孔外，每孔加入HRP标记的猪ANG-2检测抗体100μL，重新封板，37℃恒温箱避光孵育60分钟。
5. 二次洗板
再次重复上述洗板操作5次，彻底洗去未结合的游离酶标抗体，拍干孔内残留液体。
6. 底物显色
每孔依次加入底物A、底物B各50μL，轻轻晃动混匀，37℃避光孵育15分钟，此时阳性孔会逐步显现出蓝色反应。
7. 终止与读数
每孔加入终止液50μL，蓝色反应会立刻转为黄色，15分钟内将酶标仪波长设置为450nm，依次读取各孔的OD吸光度值。
8. 结果计算
以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，在Excel中绘制标准曲线并生成线性回归方程，代入待测样本的OD值，即可计算出样本中猪ANG-2的实际浓度。
🧫 实验前准备
提前将所有实验试剂从冰箱取出，室温平衡30分钟，同时预热37℃恒温孵育箱，准备好校准后的移液枪、配套枪头、96孔酶标板等耗材。
1. 抗体包被（预包被试剂盒可跳过）
将猪ANG-2特异性捕获抗体按说明书推荐比例稀释，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，次日用洗涤液洗板3次，拍干后加入封闭液室温封闭1小时，再次洗板拍干备用。
2. 加样操作
设置空白孔、标准品梯度孔、待测样本孔：
标准品孔依次加入不同浓度的猪ANG-2标准品100μL
待测样本孔先加40μL样本稀释液，再加10μL待测猪血清样本，实现5倍稀释
空白孔不加任何样本，其余操作保持一致
加样完成后轻轻晃动酶标板混匀，用封板膜封住孔口，37℃温育60分钟。
3. 洗板操作
弃去孔内所有液体，在吸水纸上充分拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后甩去液体，拍干，重复该洗板步骤5次，也可使用自动洗板机完成操作。
4. 酶标抗体孵育
除空白孔外，每孔加入HRP标记的猪ANG-2检测抗体100μL，重新封板，37℃恒温箱避光孵育60分钟。
5. 二次洗板
再次重复上述洗板操作5次，彻底洗去未结合的游离酶标抗体，拍干孔内残留液体。
6. 底物显色
每孔依次加入底物A、底物B各50μL，轻轻晃动混匀，37℃避光孵育15分钟，此时阳性孔会逐步显现出蓝色反应。
7. 终止与读数
每孔加入终止液50μL，蓝色反应会立刻转为黄色，15分钟内将酶标仪波长设置为450nm，依次读取各孔的OD吸光度值。
8. 结果计算
以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，在Excel中绘制标准曲线并生成线性回归方程，代入待测样本的OD值，即可计算出样本中猪ANG-2的实际浓度。
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