瑞孚迪高内涵成像系统助力揭示NUDT5调控嘌呤从头合成的全新机制
2026-09-14 来源:本站 点击次数:43
当细胞遇到“叶酸陷阱”，腺苷（adenosine）会从“营养补给”瞬间变成“致命毒药”。是谁在幕后调控这一生死开关？
2025年12月11日，国际顶级期刊《Science》在线发表了题为“A non-enzymatic role of Nudix hydrolase 5 in repressing purine de novo synthesis”的文章。该研究发现，NUDT5并非通过其经典的酶活性，而是作为“蛋白支架”与嘌呤从头合成的限速酶PPAT直接互作，从而在细胞感知嘌呤丰度时关闭从头合成通路。这一发现不仅改写了我们对嘌呤代谢调控的认知，也为理解MTHFD1缺乏症及嘌呤类似物抗癌药耐药机制提供了全新视角。
研究团队简介
本研究由奥地利科学院分子医学研究中心（CeMM）的Stefan Kubicek团队与英国牛津大学药物发现中心（Centre for Medicines Discovery, Oxford）的Kilian V. M. Huber团队联合主导。
研究整合了CRISPR全基因组筛选、同位素示踪代谢组学、高内涵活细胞成像、蛋白质组学、AlphaFold3结构预测及生化酶活检测等多种前沿技术，堪称代谢-成像-结构生物学的交叉典范。
原文标题、作者及摘要截图（Science 390, 1143–1150, 2025）
研究背景：MTHFD1缺陷为何让细胞“怕”腺苷？
叶酸代谢与嘌呤合成是细胞增殖的两大命脉。MTHFD1是一个位于细胞质的三功能酶，其S（合成酶）、D（脱氢酶）、C（环水解酶）三个结构域协同催化叶酸循环，为嘌呤从头合成提供关键的10-CHO-THF。
研究团队通过基因编辑构建了MTHFD1不同结构域失活的细胞模型：
- MTHFD1敲除（KO）和S结构域突变（K386E）细胞：在去除小分子的透析血清中生长受限，但补充腺苷可完全恢复增殖。
- DC结构域突变（K56R）细胞：却出现完全相反的表型——低浓度腺苷（约6μM）即产生强烈抗增殖效应，并伴随G1-S期阻滞、DNA损伤标志物γH2A.X与RPA2核foci显著升高。
这一“腺苷毒性”模型被称为遗传型叶酸陷阱（genetic folate trap）：DC结构域失活导致10-CHO-THF堆积，若此时再用腺苷抑制嘌呤从头合成，叶酸循环无法再生THF，细胞因核苷酸失衡而死亡。
图1F：MTHFD1K56R细胞在腺苷处理后，DNA损伤标志物γH2A.X（上）与复制应激标志物RPA2（下）核foci显著增加。免疫荧光图像直接可视化“叶酸陷阱”导致的DNA损伤表型。
全基因组CRISPR筛选：NUDT5横空出世
为了找到调控“叶酸陷阱+腺苷毒性”的遗传因子，研究团队在MTHFD1K56R细胞中开展了针对19,114个人类基因的全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。细胞在腺苷存在下生长14天后，只有“被敲除后能存活”的基因才会富集。
筛选结果极其聚焦：仅三个基因显著富集——MTHFD1、HPRT1和NUDT5。其中NUDT5的出现最令人意外，因为它此前主要被认为是一个水解ADP-核糖的“看家酶”，与嘌呤感应或叶酸代谢并无直接关联。
图2：全基因组筛选火山图显示NUDT5、HPRT1、MTHFD1为腺苷毒性的关键调控因子（B）；敲除NUDT5或HPRT1可恢复MTHFD1K56R细胞在腺苷中的增殖（D），并消除γH2A.X/RPA2 DNA损伤信号（E、F）。
颠覆认知：NUDT5的“酶活”不重要，“支架”才重要
研究团队首先验证了NUDT5敲除能够解除腺苷对MTHFD1K56R细胞的毒性。但关键问题是：NUDT5究竟靠什么发挥作用？
研究者设计了以下实验进行验证：
- 使用高选择性NUDT5酶活性抑制剂TH5427（生化IC₅₀仅29nM），即使浓度提高1000倍以上，也无法拯救腺苷毒性。
- 在NUDT5敲除细胞中重新表达野生型NUDT5或酶活性失活突变体NUDT5E112Q，两者均能使细胞重新对腺苷敏感。
- 开发靶向NUDT5的PROTAC降解剂dNUDT5，其在100nM时达到最大降解并完全逆转腺苷毒性，且剂量-效应曲线与NUDT5降解曲线完美重合。
结论清晰：NUDT5的酶活性可有可无，真正起作用的是它的“蛋白支架/物理存在”。
图4D：RPA2-RFP报告基因活细胞高内涵成像显示，腺苷处理使MTHFD1K56R细胞在24-48小时内出现大量RPA2核foci（复制应激）；而dNUDT5降解NUDT5后，foci形成被显著抑制。
机制揭秘：NUDT5“抱住”PPAT，关掉从头合成
既然酶活不重要，NUDT5必然通过与某个蛋白的物理互作发挥作用。研究团队通过BFP pull-down、邻近标记及化学蛋白质组学，在NUDT5的互作蛋白中一致富集到PPAT（phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase）——这正是嘌呤从头合成的限速酶。
进一步的机制研究揭示了以下关键点：
- 互作是双向且动态增强的：免疫共沉淀证实内源PPAT能拉下NUDT5，腺苷处理可显著增强NUDT5-PPAT结合。
- 通过表达PPAT能模拟NUDT5敲除的表型，提示NUDT5通过限制“游离/活性”PPAT来抑制de novo合成。
- AlphaFold3结构预测显示，两个NUDT5二聚体像“三明治”一样夹住一个PPAT四聚体，将其锁定在低活性构象。
- 突变NUDT5的Y74位点（位于预测互作环）会破坏与PPAT的结合，并导致NUDT5失去抑制PPAT活性的能力。
图5E：AlphaFold3预测的NUDT5-PPAT复合物结构。两个NUDT5二聚体（彩色）与一个PPAT四聚体（灰色）形成“三明治”样结构，关键互作残基Y74被高亮标出。
图5H：体外PPAT酶活实验。加入野生型NUDT5可显著抑制PPAT活性；而PPAT结合缺陷突变体NUDT5Y74E几乎无抑制作用。
临床启示：嘌呤类似物耐药的新机制
嘌呤类似物（如6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、氟达拉滨）是白血病、淋巴瘤及自身免疫病的一线药物。既往研究认为HPRT1或NUDT5的缺失通过改变“酶活”导致耐药。
本研究刷新了上述认知：NUDT5的“支架功能”同样足以介导耐药。研究团队筛选了422个核苷酸类似物，发现NUDT5敲除细胞对多种嘌呤类似物产生显著耐药；更令人惊讶的是，仅引入PPAT结合缺陷突变NUDT5Y74E，就能模拟NUDT5敲除的耐药表型。这意味着：
- 肿瘤细胞可能通过NUDT5突变（不影响酶活但破坏PPAT结合）逃逸嘌呤类似物治疗。
- 临床上检测NUDT5的“支架突变”可能比检测酶活突变更能预测耐药。
- 靶向NUDT5-PPAT互作界面，有望开发克服耐药或增强嘌呤类似物疗效的新策略。
瑞孚迪高内涵成像平台：从筛选到机制验证的“眼睛”
贯穿本研究的高通量表型读取、DNA损伤成像、活细胞动力学与患者细胞验证，几乎都离不开瑞孚迪（Revvity）的高内涵成像与分析平台。研究团队不仅在方法学部分多次致谢这些工具，更用它们产出了文章最核心的表型证据。
Opera Phenix OptIQ
高内涵成像分析系统
Operetta CLS
高内涵成像分析系统
- 基因编辑细胞株克隆可视化：用于mCherry标记的intron-tagging单细胞克隆筛选。
- 高通量化合物筛选：对约90,000个小分子进行Hoechst核染色成像与细胞计数，找出能拯救MTHFD1KO细胞生长的小分子。
- DNA损伤高内涵成像：对γH2A.X、RPA2等核foci进行高分辨率成像与定量，直接支持“叶酸陷阱导致复制应激”的核心论断。
- 活细胞长时程成像：对RPA2-RFP intron-tagging细胞系进行0/24/48小时动态监测，实时捕捉dNUDT5处理后的复制应激缓解过程。
- 单一代谢物补充筛选：在MTHFD1KO与MTHFD1K56R细胞中系统评估核苷/叶酸代谢物对细胞增殖的影响。
- 患者来源MTHFD1缺陷成纤维细胞检测：使用96孔光学底板（瑞孚迪）培养患者细胞，经Hoechst染色后由Operetta CLS成像，并通过Harmony软件分割核、计数，定量评估腺苷与dNUDT5抑制剂的组合效应。
- 细胞核自动分割与计数：实现从384孔/96孔板中大规模提取细胞数量、细胞周期及DNA损伤foci等表型参数。
- 与CellProfiler联用：对γH2A.X/RPA2 foci进行自定义定量，支撑“six imaged wells”的统计学结论。
参考文献
Nguyen, T.-A. et al. A non-enzymatic role of Nudix hydrolase 5 in repressing purine de novo synthesis. Science 390, 1143–1150 (2025). DOI: 10.1126/science.adv4257
2025年12月11日，国际顶级期刊《Science》在线发表了题为“A non-enzymatic role of Nudix hydrolase 5 in repressing purine de novo synthesis”的文章。该研究发现，NUDT5并非通过其经典的酶活性，而是作为“蛋白支架”与嘌呤从头合成的限速酶PPAT直接互作，从而在细胞感知嘌呤丰度时关闭从头合成通路。这一发现不仅改写了我们对嘌呤代谢调控的认知，也为理解MTHFD1缺乏症及嘌呤类似物抗癌药耐药机制提供了全新视角。
研究团队简介
本研究由奥地利科学院分子医学研究中心（CeMM）的Stefan Kubicek团队与英国牛津大学药物发现中心（Centre for Medicines Discovery, Oxford）的Kilian V. M. Huber团队联合主导。
研究整合了CRISPR全基因组筛选、同位素示踪代谢组学、高内涵活细胞成像、蛋白质组学、AlphaFold3结构预测及生化酶活检测等多种前沿技术，堪称代谢-成像-结构生物学的交叉典范。
原文标题、作者及摘要截图（Science 390, 1143–1150, 2025）
研究背景：MTHFD1缺陷为何让细胞“怕”腺苷？
叶酸代谢与嘌呤合成是细胞增殖的两大命脉。MTHFD1是一个位于细胞质的三功能酶，其S（合成酶）、D（脱氢酶）、C（环水解酶）三个结构域协同催化叶酸循环，为嘌呤从头合成提供关键的10-CHO-THF。
研究团队通过基因编辑构建了MTHFD1不同结构域失活的细胞模型：
- MTHFD1敲除（KO）和S结构域突变（K386E）细胞：在去除小分子的透析血清中生长受限，但补充腺苷可完全恢复增殖。
- DC结构域突变（K56R）细胞：却出现完全相反的表型——低浓度腺苷（约6μM）即产生强烈抗增殖效应，并伴随G1-S期阻滞、DNA损伤标志物γH2A.X与RPA2核foci显著升高。
这一“腺苷毒性”模型被称为遗传型叶酸陷阱（genetic folate trap）：DC结构域失活导致10-CHO-THF堆积，若此时再用腺苷抑制嘌呤从头合成，叶酸循环无法再生THF，细胞因核苷酸失衡而死亡。
图1F：MTHFD1K56R细胞在腺苷处理后，DNA损伤标志物γH2A.X（上）与复制应激标志物RPA2（下）核foci显著增加。免疫荧光图像直接可视化“叶酸陷阱”导致的DNA损伤表型。
全基因组CRISPR筛选：NUDT5横空出世
为了找到调控“叶酸陷阱+腺苷毒性”的遗传因子，研究团队在MTHFD1K56R细胞中开展了针对19,114个人类基因的全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。细胞在腺苷存在下生长14天后，只有“被敲除后能存活”的基因才会富集。
筛选结果极其聚焦：仅三个基因显著富集——MTHFD1、HPRT1和NUDT5。其中NUDT5的出现最令人意外，因为它此前主要被认为是一个水解ADP-核糖的“看家酶”，与嘌呤感应或叶酸代谢并无直接关联。
图2：全基因组筛选火山图显示NUDT5、HPRT1、MTHFD1为腺苷毒性的关键调控因子（B）；敲除NUDT5或HPRT1可恢复MTHFD1K56R细胞在腺苷中的增殖（D），并消除γH2A.X/RPA2 DNA损伤信号（E、F）。颠覆认知：NUDT5的“酶活”不重要，“支架”才重要
研究团队首先验证了NUDT5敲除能够解除腺苷对MTHFD1K56R细胞的毒性。但关键问题是：NUDT5究竟靠什么发挥作用？
研究者设计了以下实验进行验证：
- 使用高选择性NUDT5酶活性抑制剂TH5427（生化IC₅₀仅29nM），即使浓度提高1000倍以上，也无法拯救腺苷毒性。
- 在NUDT5敲除细胞中重新表达野生型NUDT5或酶活性失活突变体NUDT5E112Q，两者均能使细胞重新对腺苷敏感。
- 开发靶向NUDT5的PROTAC降解剂dNUDT5，其在100nM时达到最大降解并完全逆转腺苷毒性，且剂量-效应曲线与NUDT5降解曲线完美重合。
结论清晰：NUDT5的酶活性可有可无，真正起作用的是它的“蛋白支架/物理存在”。
图4D：RPA2-RFP报告基因活细胞高内涵成像显示，腺苷处理使MTHFD1K56R细胞在24-48小时内出现大量RPA2核foci（复制应激）；而dNUDT5降解NUDT5后，foci形成被显著抑制。
机制揭秘：NUDT5“抱住”PPAT，关掉从头合成
既然酶活不重要，NUDT5必然通过与某个蛋白的物理互作发挥作用。研究团队通过BFP pull-down、邻近标记及化学蛋白质组学，在NUDT5的互作蛋白中一致富集到PPAT（phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase）——这正是嘌呤从头合成的限速酶。
进一步的机制研究揭示了以下关键点：
- 互作是双向且动态增强的：免疫共沉淀证实内源PPAT能拉下NUDT5，腺苷处理可显著增强NUDT5-PPAT结合。
- 通过表达PPAT能模拟NUDT5敲除的表型，提示NUDT5通过限制“游离/活性”PPAT来抑制de novo合成。
- AlphaFold3结构预测显示，两个NUDT5二聚体像“三明治”一样夹住一个PPAT四聚体，将其锁定在低活性构象。
- 突变NUDT5的Y74位点（位于预测互作环）会破坏与PPAT的结合，并导致NUDT5失去抑制PPAT活性的能力。
图5E：AlphaFold3预测的NUDT5-PPAT复合物结构。两个NUDT5二聚体（彩色）与一个PPAT四聚体（灰色）形成“三明治”样结构，关键互作残基Y74被高亮标出。
图5H：体外PPAT酶活实验。加入野生型NUDT5可显著抑制PPAT活性；而PPAT结合缺陷突变体NUDT5Y74E几乎无抑制作用。
临床启示：嘌呤类似物耐药的新机制
嘌呤类似物（如6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、克拉屈滨、氟达拉滨）是白血病、淋巴瘤及自身免疫病的一线药物。既往研究认为HPRT1或NUDT5的缺失通过改变“酶活”导致耐药。
本研究刷新了上述认知：NUDT5的“支架功能”同样足以介导耐药。研究团队筛选了422个核苷酸类似物，发现NUDT5敲除细胞对多种嘌呤类似物产生显著耐药；更令人惊讶的是，仅引入PPAT结合缺陷突变NUDT5Y74E，就能模拟NUDT5敲除的耐药表型。这意味着：
- 肿瘤细胞可能通过NUDT5突变（不影响酶活但破坏PPAT结合）逃逸嘌呤类似物治疗。
- 临床上检测NUDT5的“支架突变”可能比检测酶活突变更能预测耐药。
- 靶向NUDT5-PPAT互作界面，有望开发克服耐药或增强嘌呤类似物疗效的新策略。
瑞孚迪高内涵成像平台：从筛选到机制验证的“眼睛”
贯穿本研究的高通量表型读取、DNA损伤成像、活细胞动力学与患者细胞验证，几乎都离不开瑞孚迪（Revvity）的高内涵成像与分析平台。研究团队不仅在方法学部分多次致谢这些工具，更用它们产出了文章最核心的表型证据。
Opera Phenix OptIQ
高内涵成像分析系统
Operetta CLS
高内涵成像分析系统
- 基因编辑细胞株克隆可视化：用于mCherry标记的intron-tagging单细胞克隆筛选。
- 高通量化合物筛选：对约90,000个小分子进行Hoechst核染色成像与细胞计数，找出能拯救MTHFD1KO细胞生长的小分子。
- DNA损伤高内涵成像：对γH2A.X、RPA2等核foci进行高分辨率成像与定量，直接支持“叶酸陷阱导致复制应激”的核心论断。
- 活细胞长时程成像：对RPA2-RFP intron-tagging细胞系进行0/24/48小时动态监测，实时捕捉dNUDT5处理后的复制应激缓解过程。
- 单一代谢物补充筛选：在MTHFD1KO与MTHFD1K56R细胞中系统评估核苷/叶酸代谢物对细胞增殖的影响。
- 患者来源MTHFD1缺陷成纤维细胞检测：使用96孔光学底板（瑞孚迪）培养患者细胞，经Hoechst染色后由Operetta CLS成像，并通过Harmony软件分割核、计数，定量评估腺苷与dNUDT5抑制剂的组合效应。
- 细胞核自动分割与计数：实现从384孔/96孔板中大规模提取细胞数量、细胞周期及DNA损伤foci等表型参数。
- 与CellProfiler联用：对γH2A.X/RPA2 foci进行自定义定量，支撑“six imaged wells”的统计学结论。
参考文献
Nguyen, T.-A. et al. A non-enzymatic role of Nudix hydrolase 5 in repressing purine de novo synthesis. Science 390, 1143–1150 (2025). DOI: 10.1126/science.adv4257
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