脱蜡‑双光子荧光显微镜成像实现人脑病理样本三维定量分析
2026-09-21 来源:本站 点击次数:50关键词：脱蜡人脑；双光子成像；细胞构筑定量
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人脑组织是神经病理领域海量的存档临床样本资源，但传统病理分析仅依靠二维切片，丢失了细胞空间排布的三维信息。该研究搭建一套完整的技术流程，对脱蜡后的人 FFPE 脑组织开展三维光学成像与机器学习驱动的细胞表型定量分析。这套流程可兼容成人与儿科、正常与病变脑组织，获取神经元形态、局部细胞密度、空间聚集程度等量化指标，能够挖掘基因型表型关联，为解析脑部疾病发病机制、拓展治疗方案提供新的数据支撑。
该研究的主要发现者为 Danila Di Meo、Michele Sorelli、Josephine Ramazzotti、Franco Cheli、Samuel Bradley、Laura Perego、Beatrice Lorenzon、Giacomo Mazzamuto、Aron Emmi、Andrea Porzionato、Raffaele De Caro、Rita Garbelli、Dalila Biancheri、Cristiana Pelorosso、Valerio Conti、Renzo Guerrini、Francesco S. Pavone、Irene Costantini。论文标题为《Quantitative cytoarchitectural phenotyping of deparaffinized human brain tissues》，发表于《Communications Biology》。
重要发现
01脱蜡、组织透明化与三维样本制备存档FFPE 人脑块首要障碍是石蜡基质，石蜡会阻挡透明化试剂渗透，造成透光不均，同时阻碍抗体标记。过往剧烈脱蜡方案会破坏组织蛋白抗原，仅适用于核酸与蛋白提取，无法保留完整组织架构；少数温和脱蜡方案仅在肺、淋巴结、肿瘤组织开展测试，尚未适配人脑样本。
研究开发温和人脑脱蜡方案：60℃水浴融化样本外部石蜡，之后多次二甲苯震荡洗涤彻底清除组织内部石蜡，经梯度乙醇完成样本复水。脱蜡完成后切取 500 μm 厚度脑片，分别搭配 SHORT 与 iDISCO 两种组织透明化流程开展测试。SHORT 方法可以有效淬灭脂褐素带来的自发荧光，对儿科样本标记效果更优；iDISCO 同样可实现样本透明与多标记染色，但成人样本会出现较强脂褐素自发荧光。两种方案都可完成多分子标记，识别 γ氨基丁酸能中间神经元、神经元核抗原、磷酸化核糖体蛋白 S6 等多种靶标。
02三维成像采集策略
研究采用两种三维荧光成像手段。光片荧光显微（LSFM）适合大体积脑组织快速重建，成像体素各向同性为 3.64 μm，可完成厘米级尺度脑样本快速介观三维重构，但容易受样本残留不透明结构产生条纹伪影，形态测量精度有限。双光子荧光显微（TPFM）无阴影伪影，可实现更高分辨率成像，成像体素设置为 1.21 μm ×1.21 μm ×2 μm，适合开展精细神经元形态定量，但采集耗时更长。
为消除照明不均，双光子原始图像采用CIDRE 算法进行平场校正，相邻图像瓦片依靠 ZetaStitcher 完成配准拼接，生成完整的三维介观重建数据集。光片原始数据经过仿射变换完成剪切、缩放、旋转校正，输出各向同性三维体积数据。
03机器学习细胞分割与定量细胞构筑分析依托ilastik 工具构建两套随机森林机器学习工作流，分别执行像素分类与对象分类。像素分类将体素划分为 pRPS6 阳性神经元、pRPS6 阴性神经元、血管、背景四类，训练由多名实验人员手动标注完成，测试集袋外误差为 2.8%，两类神经元 F1 得分中位数均为 0.78。对象分类环节对像素分类输出概率图做迟滞阈值二值化，处理细胞粘连合并问题，过滤假阳性检测目标，避免细胞密度被低估。
选取两例IIa 型局灶性皮质发育不良儿科手术脑组织开展定量比对。样本 S1 携带 PTEN 基因意义未明变异，样本 S2 携带 mTOR 通路的致病体细胞变异。分析指标包含神经元胞体体积、椭圆率、150 μm 半径范围内局部细胞密度、基于 RipleyK 函数计算的细胞聚集指数。结果显示 S2 样本 pRPS6 阳性神经元占比显著高于 S1，这类细胞同时具备更大胞体体积与更高椭圆率，对应畸形巨神经元病理特征。S1 的 pRPS6 阳性神经元聚集指数分布范围广，同时存在孤立细胞与局部细胞簇；S2 该类神经元呈空间均匀分布。即便 pRPS6 阴性神经元，两组样本在体积、椭圆率、局部密度上同样存在统计学差异。
创新与亮点
该研究建立适配FFPE 人脑块的温和脱蜡流程，填补人脑存档样本脱蜡后联合透明化三维成像的技术空白，可充分挖掘海量临床石蜡存档样本的科研价值。结合光片与双光子两种成像手段，兼顾大样本快速成像与亚细胞分辨率精细测量，利用监督机器学习实现三维空间内神经元亚群自动分割，输出细胞形态与空间分布的定量指标，摆脱传统二维组织学只能切片抽样、依赖人工体视学计数的局限。该技术可应用于皮质发育畸形、海马硬化等癫痫相关脑组织研究，用于解析体细胞突变对应的细胞构筑改变，挖掘新的病理形态学标志物，辅助疾病分型与发病机制研究。
总结与展望
本研究建立从FFPE 人脑组织脱蜡、透明标记、三维成像到机器学习定量细胞表型的完整工作流程，证明存档石蜡人脑样本可以实现细胞分辨率三维定量分析。研究证实携带不同 mTOR 通路变异的局灶皮质发育不良样本，神经元形态与空间聚集模式存在显著三维特征差异。未来该方法可拓展更多临床病例，探究细胞聚集特征与致痫灶的关联，发掘新型病理标志物，完善脑部病变三维病理评估体系。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Di Meo, D., Sorelli, M., Ramazzotti, J. et al. Quantitative cytoarchitectural phenotyping of deparaffinized human brain tissues. Commun Biol 8, 1527 (2025).
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-025-08887-y