BRL 3A 源自Buffalo rat的正常肝脏组织，是BRL细胞的单克隆亚株，呈成纤维样贴壁生长，该细胞增殖较快，可分泌增殖刺激活性因子MSA，常用于生长因子及肝脏细胞生物学、肝脏代谢、药物肝毒性评价研究。该细胞贴壁较牢，对培养基与胰酶消化条件有一定要求，传代操作中需严格把控。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至37℃；准备含10%FBS的完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL完全培养基于37℃预热；安全柜紫外30min。

2.【融化】从液氮/冰箱取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1-2min。

3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，安全柜内开盖，细胞悬液沿管壁缓慢滴入含9mL预热完全培养基的离心管，轻柔混匀。

4.【离心】300×g离心5-10min，弃上清，去除DMSO。

5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25瓶（4-6mL培养基），十字混匀，标注信息。

6.【培养】放入37℃、5%CO2培养箱；次日换液去除死细胞碎片。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出PBS（abs962-500ml/SV30305.01）、完全培养基、0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。

2.【镜检】融合度达80%-90%、成纤维样细胞铺展饱满即可传代。

3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿瓶壁缓慢加入2-3mL PBS（abs962-500ml/SV30305.01），轻摇覆盖，吸弃。

4.【细胞消化】加入0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）覆盖瓶底，37℃消化3-5min，镜下见细胞脱壁即加等量完全培养基终止（BRL贴壁较牢，需延至脱壁）。

5.【离心】300×g离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻吹打重悬。

6.【传代】按1:2-1:6接种至新瓶，补加完全培养基，十字混匀，标注信息。

7.【镜检】镜下确认分散，放入37℃、5%CO2培养箱，约2-3天观察（每周传代2次）。

注意：BRL 3A贴壁较牢，消化需镜下确认脱壁（3-5min），切勿未脱壁即强行吹打；传代频率约2-3天/次，密度过低恢复慢。

三、细胞冻存

1.【准备工作】冻存液：无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）或90% FBS（货号：abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL）；冻存管标注信息；安全柜紫外30min。

2.【细胞收集】融合度80%-90%时按传代消化收集，300×g离心后弃上清。

3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔重悬，细胞密度约1-5×10⁶/mL。

4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转液氮长期保存。

四、关键注意事项

1、贴壁与消化

（1）融合度80%-90%传代；

（2）胰酶3-5min，贴壁牢固，以镜下脱壁为准；

（3）传代比1:2-1:6，每周约2次。

2、培养基选择

（1）标准 Eagle's MEM + 10% FBS；

（2）亦可 DMEM高糖 + 10% FBS，保持条件一致即可。

3、形态与污染判断

（1）正常：成纤维样、贴壁、梭形交织；

（2）异常：大量圆缩脱落、培养基浑浊（污染）。

参考资料

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