水质粪大肠菌群的测定滤膜法

1适用范围

本标准规定了测定水中粪大肠菌群的滤膜法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。
本方法的检出限：当接种量为100ml时，检出限为10CFU/L；当接种量为500ml时， 检出限为2 CFU/L。

2规范性引用文件

本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本 标准。

GB/T 14581水质湖泊和水库采样技术指导
HJ494水质采样技术指导
HJ/T91地表水和污水监测技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3. 1粪大肠菌群 fecaI col iforms

又称耐热大肠菌群(thermotolerant coliforms)。44.5°C培养24h,能在MFC选择性培养 基上生长，发酵乳糖产酸，并形成蓝色或蓝绿色菌落的肠杆菌科细菌。

3. 2菌落形成单位 colony-forming un i ts (CFU)

单位体积样品中的细菌群落总数。

4方法原理

样品通过孔径为0.45um的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于MFC选 择性培养基上，在特定的温度(44.5°C)下培养24 h,胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长， 粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或 蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。

5干扰和消除

5.1活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集(8.1) 时加入硫代硫酸钠溶液（6.6）消除干扰。

5.2重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品 采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.7）消除干扰。

6试剂和材料

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馅 水或去离子水。
 

胰腺 10 g
蛋白腺 5g
酵母浸膏 3g
氯化钠 5 g
乳糖 12.5 g
胆盐三号 1.5 g
1%苯胺蓝水溶液 10 ml
1%玫瑰红酸溶液（溶于8.0 g/L氢氧化钠液中） 10 ml

将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰红酸外），溶解于1000 ml水中，调节pH至 7.4,分装于三角烧瓶内，于115°C高压蒸汽灭菌20 min，储存于冷暗处备用。临用前，按上 述配方比例，用灭菌吸管分别加入巳煮沸灭菌的1%苯胺蓝水溶液1 ml及1%玫瑰红酸溶液 （溶于8.0 g/L氢氧化钠液中）1ml,混合均匀。如培养物中杂菌不多，则不加玫瑰红酸亦 可。加热溶解前，加入1.2%〜1.5%琼脂可制成固体培养基。也可选用市售成品培养基。配 制好的培养基避光、干燥保存，必要时在5°C±3°C冰箱中保存，分装到平皿中的培养基可 保存2〜4周。配制好的培养基不能进行多次融化操作，以少量勤配为宜。当培养基颜色变 化，或脱水明显时应废弃不用。
 

6. 3无菌水：取适量实验用水，经121°C高压蒸汽灭菌20 min,备用。

6.4 硫代硫酸钠（Na2S2O3*5H2O）。

6.5 乙二胺四乙酸二钠（CioHi4N208Na2.2H2。）。

6. 6 硫代硫酸钠溶液：p （NazSzCh） =0.10 g/ml

称取15.7 g硫代硫酸钠（6.4）,溶于适量水中，定容至100 ml，临用现配。

6.7 乙二胺四乙酸二钠溶液：p （Ci₀Hi₄N2O₈Na2-2H2O） =0.15 g/ml

称取15 g乙二胺四乙酸二钠（6.5）,溶于适量水中，定容至100 ml,此溶液可保存30 d。

7仪器和设备

7. 1采样瓶：1L、500 ml或250 ml带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。

7.2高压蒸汽灭菌器：115°C、12 PC可调。

7.3恒温培养箱：允许温度偏差44.5°C ±0.5°C »

7.4过滤装置：配有砂芯滤器和真空泵，抽滤压力勿超过-50 kPa。

7.5 pH计：准确到0.1 pH单位。

7. 6培养皿：直径90 mm。

7.7 一般实验室常用仪器和设备。

注：玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121笆高压蒸汽灭菌20 min备用。

8样品

8. 1样品采集

点位布设及采样频次按照GB/T 14581、HJ/T494和HJ/T91的相关规定执行。

采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。样 品采集量可根据水体实际情况而定，一般不少于250 ml。

采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水 面10-15 cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水 中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。样 品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。

从龙头装置采集样品时，不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大，放水3〜5 min, 然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3 min灭菌或用70%〜75%的酒精对龙头进行消毒，开足龙 头，再放水1 min,以充分除去水管中的滞留杂质。采样时控制水流速度，小心接入瓶内。

采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。

在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。

如果采集的是含有活性氯样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.6）,以除去 活性氯对细菌的抑制作用（每125 ml容积加入0.1 ml的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重 金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.7）,以消除干 扰（每125 ml容积加入0.3 ml的乙二胺四乙酸二钠溶液）。

注：15.7 mg硫代硫酸钠（6.4）可去除样品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯 量调整。

8. 2样品保存

采样后应在2h内检测，否则，应10°C以下冷藏但不得超过6h。实验室接样后，不能 立即开展检测的，将样品在4°C以下冷藏并在2 h内检测。

9分析步骤

9. 1样品过滤

根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为10ml,如接种量小于10ml时应逐级稀释。 先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。理 想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为20〜60个，总菌落数不得超过200个。

当最小过滤体积为10 ml,滤膜上菌落密度仍过大时，则应对样品进行稀释。1:10稀释的方法 为：吸取10ml样品，注入盛有90 ml无菌水（6.3）的三角烧瓶中，混匀，制成1:10稀释样品。 样品接种量参考

表见表1。

表1接种量参考表

 

 
用灭菌镶子以无菌操作夹取无菌滤膜（6.2）贴放在己灭菌的过滤装置（7.4）上，固定 好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水（6.3）冲洗器壁2〜3次。样品过滤完成后， 再抽气约5 s,关上开关。

9.2培养

用灭菌镶子夹取滤膜移放在MFC培养基（6.1）上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培 养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将培养皿倒置，放入恒温培养箱内,44.5°C ±0.5°C 培养 24h±2h。

9.3对照试验

每次试验都要用无菌水（6.3）按照步骤9.1和9.2进行实验室空白测定。

9. 3. 2阳性及阴性对照

将粪大肠菌群的阳性菌株（如大肠埃希氏菌Escherichia coli）和阴性菌株（如产气肠杆 菌Enterobacter aerogenes）制成浓度为40~600 CFU/L的菌悬液，分别按照9.1~9.2步骤培养， 阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查 明原因后重新测定。

10结果计算与表示

10. 1结果判读

MFC培养基上呈蓝色或蓝绿色的菌落为粪大肠菌群菌落，予以计数。

MFC培养基上呈灰色、淡黄色或无色的菌落为非粪大肠菌群菌落，不予计数。 结果判读参考图片见图1。


无菌落生长
 
图1结果判读参考图片

10.2结果计算

样品中的粪大肠菌群数（CFU/L），按照公式（1）进行计算:

八 Ci*1000C =

式中：C——样品中粪大肠菌群数，CFU/L；
Ci——滤膜上生长的粪大肠菌群菌落总数，个；
1000——将过滤体积的单位由ml转换为L ；
/——样品接种量，ml；

注：若平行样结果都在20〜60 CFU/L范围内，最终结果取平均值以几何平均计算。

10.3结果表示

测定结果保留至整数位，最多保留两位有效数字，当测定结果N100CFU/L时，以科学 计数法表示。粪大肠菌群检验记录及报告格式参见附录A。

11精密度和准确度

11.1精密度

6个实验室对低浓度（地下水，浓度均值为2.0X10² CFU/L）、中浓度（地表水，浓度 均值为

1.6X105CFU/L）和髙浓度（生活污水，浓度均值为1.6X10⁷ CFU/L）三个不同浓度 粪大肠菌群的实际

样品和有证标准样品（浓度为3670 MPN7L,可接受范围为330〜 7710MPN/L）进行了6次重复测定：
实验室内相对标准偏差范围分别为5.3%〜12%、0.81%〜 2.1%、0.51%〜4.2%和7.7%〜9.8%；实验室间相对标准偏差分别为6.8%、3.9%、4.0%和3.6%； 实验室间95%置信区间见表2 o

表2实验室间95%置信区间

 

 
11.2准确度

6个实验室对含粪大肠菌群浓度为3670MPN7L （可接受范围为330-7710 MPN/L）的标 准样品进行了6次重复测定：相对误差范围为-19%〜-32%；相对误差最终值为：-23%±10%。

注：微生物检测数据为偏态分布，其测定结果全部经以10为底对数转换后进行计算。

12质量保证和质量控制

12. 1培养基检验

更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验，将粪大肠菌群测定的阳性菌株（如 大肠埃希氏菌Escherichia coli）和阴性菌株（如产气肠杆菌Enterobacter aerogenes）配成适 宜浓度，按样品过滤（9.1）的要求使滤膜上生长的菌落数为20〜60个，然后按培养（9.2）的要求进行操作，阳性菌株应生长为蓝色或蓝绿色菌落，阴性菌株应生长为灰色、淡黄色、 无色或无菌落生长。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

12.2对照试验

12.2. 1空白对照

每次试验都要用无菌水做实验室空白测定（9.3.1）,培养后的培养基上不得有任何菌落 生长。否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

12.2.2阳性及阴性对照

定期按照9.3.2进行阳性及阴性对照试验，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现 阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应查明原因后重新测定。

13废物处理

使用后的废物及器皿须经121°C髙压蒸汽灭菌30 min或使用液体消毒剂（自制或市售） 灭菌后，器皿方可清洗，废物作为一般废物处置。

14注意事项

当样品浑浊度较高时，应选用其他方法。