美国哥伦比亚大学的Richard Axel课题组于2021年10月27日在Neuron上发表了题为“Olfactory landmarks and path integration converge to form a cognitive spatial map”的文章，在这项研究中，Fischler-Ruiz等人展示了当小鼠利用气味线索在黑暗中导航时，海马神经元的活动是如何通过感觉特征识别出位置信息的。他们通过使用Inscopix自由活动钙成像显微镜记录海马CA1的神经活动，发现路径整合对气味线索施加了空间意义，从而创造了新的位置标记，极大提高了导航能力，并且同一气味出现在不同的位置是也产生了不同的位置细胞（Place Cell）的表征。



摘要

内部路径整合和外部感觉标志的融合在海马体中生成认知空间图。在一个虚拟导航任务中，作者使用Inscopix钙成像显微镜记录了CA1细胞的活动，来研究小鼠如何表现、识别和使用局部的嗅觉气味线索来估计自己的位置。作者观察到在虚拟环境中的多个位置存在气味线索极大地丰富了位置细胞的表征，并改善了导航。在不同位置呈现相同的气味会产生不同的位置细胞表示。近端位置的气味线索增强了局部位置细胞密度，也导致位置细胞超出提示的形成。这导致将第二个更远的气味线索识别为独特的地标，这表明将空间表征扩展到未知领域的迭代机制。这项研究结果表明，气味可以作为位置标志，并启动路径整合和气味线索依次迭代的相互作用模型，从而形成长距离的认知空间地图。

正文

路径整合是一种导航策略，允许动物形成相对于外部路标的内部位置估计。路径整合依赖于来自前庭、本体感受、视觉流和运动源的脑(自主运动)信号，这些信号提供了对运动的不完美估计。内部位置估计中的累积误差必须通过外部路标加以纠正。路径整合和外部地标的汇合扩大了动物精确导航的范围。

地标的识别提出了一个有趣的概念问题。地标的感官特征没有内在的空间意义，只有在空间中被认定为固定的时候才有价值，而这一确定可能需要路径整合。如果在不同的位置遇到相同的感觉特征，则会出现进一步的消歧问题。路径整合和感官特征的融合创造了一个认知空间地图，可以在这些特征上施加独特的空间意义，从而创建地标。

气味是感官信息的主要来源，如果固定在空间中，气味可以作为导航路标。海马接受来自外侧内嗅皮层(LEC)的嗅觉信息。LEC接受来自嗅球和梨状皮层的直接输入，这两个结构负责编码气味身份。气味对海马活动的影响已经在空间和非空间环境中被观察到。内侧内嗅皮层(MEC)的网格、头部方向和速度细胞受内部路径整合信号驱动，向海马提供位置和自我运动信息。在黑暗中，这些内部路径整合信号，结合嗅觉和/或触觉线索，能够支持海马体中稳定的空间表征。因此，海马体是内部路径整合和外部感觉标志的潜在汇聚点。

作者检测了小鼠海马神经元的活动，在执行导航行为时，依赖路径整合和稀疏的嗅觉感官线索。这些实验结果表明，路径整合和路标在海马体认知空间地图的形成过程中具有收敛性。这些观察导致了一个理论模型的形成，以描述路径整合和嗅觉地标如何在一个迭代过程中相互作用，形成一个认知空间地图。

1存在于嗅觉标志下的精确导航行为

作者设计了一系列实验，让小鼠在黑暗中基于路径整合结合嗅觉地标导航到一个虚拟的目标位置。开始，训练头部固定的小鼠在一个球形跑步机上行走4米，在完全黑暗中到达一个没有标记的目标位置，并获得饮水奖励(图1A)。这项任务要求小鼠使用基于内部独特信号的路径整合来估计自己和目标的位置。在没有气味的情况下，行为表现在1-2周后趋于稳定(n = 5只小鼠)。小鼠在沿4米轨道移动约2米后就开始舔舐，并降低了奔跑速度(图1B、1C、1D)。因此，在这个实验中，依靠路径整合是不可能精确测量大于2米的距离。

接下来，在小鼠到达1米和3米的位置时，作者引入了两次短暂的相同气味脉冲(图1E)。光离子检测器(PID)的测量结果显示，1-m和3-m脉冲产生的气味浓度只有1%的差异(图1F)。实验使用两种中性气味，柠檬烯或蒎烯，进行随机交叉实验。经过四天的气味提示训练后，所有的小鼠都抑制了舔舐，并保持了3.5米的高速奔跑后，才开始舔舐，并在距离奖励地点0.5米的地方迅速减慢了它们的奔跑速度(图1C、1D、1G)。这表明，小鼠将气味识别为空间地标，并利用这些地标来改善导航。

图1 存在于嗅觉标志下的精确导航行为

2 嗅觉标志增强了CA1中的位置细胞的活动水平

作者使用微型显微镜(nVista, Inscopix)和遗传编码的荧光Ca2+指示剂GCamp6f在每个实验中对~ 3000个CA1锥体神经元进行成像采集。使用Inscopix Data Processing Software(IDPS)识别单个神经元和它们的Ca2+迹线，并将它们的活动记录到虚拟轨道上小鼠的轨迹上。神经和行为数据在行为窗口100毫米的中取平均值进行分析。具有一致位置选择活动的神经元被分类为位置细胞。
 

图2 嗅觉标志增强了CA1中的位置细胞的活动水平

在1-2周没有气味线索的训练后，5.8%的成像神经元被归类为位置细胞(2893个神经元中的169个;图2 A-2C)。位置细胞的空间密度在起始位置比较大，并随距离迅速衰减(长度常数±引导标准误差:0.97±0.20 m;图2D)。位置场的可靠性随着离起始位置的距离的增加而降低，而位置场的抖动和宽度则随着小鼠穿过轨迹的增加而增加(图2E)。在种群水平上，种群活动载体的跨试验稳定性随距离的增加而降低(0.44±0.02 vs 0.23±0.01;图2F)。这些结果表明，在这种模式下，靠路径整合无法支持超过~2 m的位置细胞活性。~2 m以上空间的神经表征稀疏且不可靠，与小鼠在~2 m开始舔舐的行为观察相一致，可能反映了路径整合中的错误积累。

接下来，作者研究了空间定位气味线索是否会增强位置细胞的表征。小鼠在1米和3米的气味提示下连续4天完成该任务后，位置细胞的百分比从5.8%增加到35%(2778个神经元中有979个是柠檬烯和蒎烯结合的位置细胞;图2G-2I)。位置细胞的密度随着轨迹长度的增加而增加，但在1 m和3 m之后明显，气味呈现的位置肯定(图2D)。重要的是，尽管在这两个地方暴露于相同的气味，不同组的位置细胞在1m和3m处仍然活跃。作者还观察到在气味呈现的两个部位都有反应的神经元相对较少(图2J；2.4%， 2778个神经元中有68个)。三个间隔峰的存在(在起始点和两个气味点)使得位置细胞密度在整个轨迹上保持高水平，尽管峰之间存在衰减。气味训练后，位置场的可靠性增加，而位置场抖动有降低的趋势(图2E)。在种群水平上，气味训练后种群活动载体的跨试验稳定性增加(0.36±0.01 vs 0.61±0.01;图2F)。位置细胞密度的增加和可靠性的提高与动物在气味提示时抑制舔舐和保持跑向奖赏区域的能力是一致的。位置细胞在3米气味线索处的峰值和上升的位置细胞密度一直到奖励位置，这与使用认知空间地图来支持导航是一致的。

对单个试验的位置细胞活性分析显示，在1-m和3-m气味线索处活跃的位置细胞数量之间存在相关性(图2K)。这表明在空间导航过程中，近地标位置细胞的密度会影响远地标位置细胞的密度。

在对CA1种群活动的位置进行解码后，作者观察到，小鼠在很大程度上调整了距离估计和舔舐行为，以响应一次又一次的速度偏差，显示出CA1神经活动和导航行为之间的联系。重要的是，这表明，动物在执行任务时使用路径整合，将气味线索识别为空间地标，而不是使用经过时间的估计。综上所述，这些结果表明气味线索可以作为路标，与路径整合结合，产生强大的空间依赖神经活动，支持准确的导航行为。

3 嗅觉标志诱导位置细胞重新定位，产生不同的认知空间地图

通过柠檬烯和蒎烯的交错实验，研究了不同的气味是否会引起不同的空间图。这两种气味产生了不同的位置细胞表示，显示了重新映射(图3A)。在柠檬烯和蒎烯实验中，除了位置1的气味线索(1米)，只有11%的位置细胞(708个位置细胞中的78个)在相同的位置兴奋。根据这些发现，在位置1个气味线索之后，群体活动的试验平均向量之间的相关性从相同气味的80%下降到不同气味的15%，并且在1 m以上仍然很小(图3B)。柠檬烯和蒎烯试验之间的重新映射早在训练的1天就被观察到在气味线索的存在(图3C)。这些数据表明，在相同的任务中，相同位置的不同气味会产生不同的认知空间地图。
 

图3 嗅觉标志诱导位置细胞重新定位，产生不同的认知空间地图

4 位置细胞图的逐渐和连续出现以及导航行为的改进

作者进一步分析了路径整合和气味线索的相互作用，考察了位置细胞在训练过程中的出现和导航行为的相关改善。在气味提示下进行训练的1天，小鼠开始舔舐并在约2米时降低奔跑速度，而在3米气味提示开始时短暂抑制舔舐并提高奔跑速度(图4A和4B)。通过计算舔舐比率来量化预期舔舐行为，定义为奖励0.3 m内的平均舔舐率除以虚拟轨迹后3 m内的平均舔舐率。在第1天的气味训练后，小鼠的舔舐率随每1天的气味训练而增加，可以看到舔舐率从2.74±0.18增加到7.14±0.20(图4D)。这些观察结果表明，小鼠利用路径整合来优化它们的导航行为。位置细胞标记的演变反映了导航行为的逐步改进。在随后的训练中，位置细胞的数量和密度逐渐增加(图4F, 4G)。相应的，解码后的位置估计误差减小了2倍以上(第1天为0.46 m，第4天为0.22 m;图4H)。在数天的时间里，随着更多的位置细胞在1 ~ 3 m的区域响应，细胞密度在1 m和3 m处的峰值出现是循序渐进的。空间地图扩展的迭代过程中，越来越远端的感觉线索被识别为地标。这种迭代过程可能是将认知空间地图扩展到未知领域的基本机制。
 

图4 位置细胞图的逐渐和连续出现以及导航行为的改进

5 CA1中的种群水平活动和状态空间轨迹反映了认知空间地图的逐渐演化

在气味存在的1天训练中，作者观察到群体向量的相关性在x = 1 m之后立即出现一个峰值，这意味着位置2的气味线索处的群体向量重新对齐到位置1的气味线索处的状态。在气味训练过程中，x = 1 m后的相关性明显减弱。经过气味训练后，在第二个气味线索处的群体反应与在位置1的气味线索处的反应不相关(图5A)。这一结果与空间策略一致，而不是基于感官辨别的策略。此外，作者观察到，在4天的气味线索训练过程中，从第1天到第4天，在两个气味位置作出反应的神经元数量减少了2倍以上(图5B, 5C, 5D，和1J；第1天2405个神经元中有137个，占5.7%，，第4天2778个神经元中有68个，占2.4%)。这些数据表明，这两种气味线索被逐渐地、顺序地识别为空间地标，标志着不同的位置。

采用主成分分析(PCA)来研究小鼠学习任务时神经群体活动的状态空间轨迹。经过4天的气味训练，二维神经轨迹具有闭环的形状，轨迹上的距离与神经轨迹上相应的距离大致成正比(36.5%方差；图5E)。因此，这种低维神经活动投影的轨迹与任务具有拓扑和测量上的相似性。

在气味暴露的1天，超过气味提示的轨迹在3 m处循环，并沿着与气味提示1 m处轨迹相似的路径返回(图5F)。通过训练减少了反向循环，到第四天就没有了（图5G和5H）。因此，由1-m和3-m气味线索引起的群体反应的去相关伴随着神经轨迹与空间的分离。
 

图5 CA1中的种群水平活动和状态空间轨迹反映了认知空间地图的逐渐演化

6 去除气味线索或奖励位置会改变位置细胞的表征

在没有气味提示的情况下，气味训练中出现的丰富的位置细胞表征和改善的导航行为是否持续存在呢？在第5天，经过4天的气味训练后，小鼠进行了一个疗程，其中蒎烯试验与无气味试验随机交叉（图6A）。通过比较，第5天的位置细胞数量比第0天大（图6B和6C），舔舐行为比第0天更准确（图6D）。在有气味提示的第5天试验中，超过2米的位置细胞数量是没有气味的试验中的2.4倍（3087个神经元中有308个，而3087个神经元中有128个，图6E和6F）。此外，在没有气味提示的第5天试验中，预期舔舐的准确性较低（图6G）。

接下来，作者探讨了位置细胞活动对奖赏的依赖性。在第6天，小鼠进行了一次没有给予水奖励的实验（图6H）。在这些条件下，小鼠以相似的速度奔跑，但在4米时不舔也不停（图6I和6J）。位置细胞的比例从35%降至0.7%（3919个神经元中有29个，柠檬烯试验18个，蒎烯试验11个；图6K）。因此，在这项任务中，鲁棒的位置细胞表示取决于奖励的存在。当奖励被扣留时，位置细胞的缺失可能反映了奖励线索提供的空间信息的丢失或任务动机的缺乏。
 

图6 去除气味线索或奖励位置会改变位置细胞的表征

7 在细胞形成过程中路径整合和气味线索的收敛模型

气味线索可以作为导航陆地标记的观察结果激发了一个模型来解释路径整合和气味线索的融合如何在海马体中生成认知空间图。该模型包括由一组路径积分器的输入驱动的位置细胞群，以及从位置细胞返回到路径积分器的反馈（图7A）。随着路径整合变得不那么可靠，试验间方差随着行驶距离的增加而增加（图7B）。
 

图7 在细胞形成过程中路径整合和气味线索的收敛模型

模型位置细胞通过模拟CA1位置细胞形成期间观察到的平台电位效应的过程形成。在此为路径积分器选择了一个噪声水平，以便可靠的位置单元在距离小于2m的地方形成（图7C）。然后在3米气味线索的位置重复该过程，形成一个迭代过程，使整个4米轨迹上的完整位置单元表示成为可能（图7D）。

作者描述的系统由两个网络组成：位置细胞和路径积分器，它们在位置单元细胞时将它们之间的关系的轨迹存储在它们的突触中。位置细胞较大限度地由路径积分器驱动，路径积分器与位置场形成时发生的输入相匹配。该系统通过一个外部事件进行校准，该事件确定这些关系何时一致。这一事件是一个里程碑。

该模型也与实验观察结果一致。首先，在模型和气味训练后的实验数据中，不同位置的等效感觉输入启动了不同的位置细胞亚群。其次，该模型预测，位置细胞密度和可靠性随着距离气味线索的距离而降低，每个线索所在位置的密度和可靠性出现局部峰值（图7E和7F）。此外，该模型预测，在存在气味线索的情况下，整个轨迹上位置单元的可靠性将随着训练而提高（图7F和7G）。这两个模型预测与实验数据一致（图2D和2E）。
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该模型提出的空间地图扩展的迭代机制与在训练过程中关于位置单元表示的进化的实验结果是一致的。也就是，气味可以作为位置标志，激发路径整合和气味线索依次迭代的相互作用模型，从而形成长距离的认知空间地图。

结论
作者使用Inscopix显微镜成像CA1细胞的活动与理论建模相结合，为气味线索作为位置标记信号的过程提供了有力的证据，在迭代扩展后会形成海马的认知空间地图。

参考文献:

Fischler-Ruiz W, Clark DG, Joshi N, Devi-Chou V, Kitch L, Schnitzer M, Abbott LF, Axel R. Olfactory landmarks and path integration converge to form a cognitive spatial map, Neuron (2021), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.09.055
 

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