电致化学发光成像装置的原理、新进展和应用
2022-09-14 来源:本站 点击次数:11172
本文作者：赵微 博士
电致化学发光（electrogenerated chemiluminescence，ECL），又称电化学发光，源于电化学反应电子传递过程中将电能转化为辐射能的过程。发光分子在电极表面经过氧化还原过程生成激发态，进而退激产生发光。
针对电致化学发光的详细研究始于二十世纪六十年代，随着电子技术以及高灵敏的光电传感器如光电倍增管、单光子计数器的出现，电致化学发光传感得到了迅猛发展。近年来，结合光学显微镜与电子倍增图像传感器（EMCCD）的电化学发光显微镜（ECLM）获得了极大的关注，成为电化学测量中一种创新性的技术手段。
电化学发光成像具有低背景、无光热效应、高通量、高时间分辨率、可控性好等优点，为研究微纳界面电化学反应过程提供了极具发展潜力的技术手段。这种成像技术在能源、材料及生命分析领域，具有卓越的应用前景。
1. 电致化学发光原理
电致化学发光是一种在电极表面通过电化学引发的特异性化学发光反应[1]。在外加电激励下，电极表面首先发生电化学反应并产生化学发光所需的活性中间体，随后中间体之间或者中间体与共反应剂提供的高能自由基之间相互作用，形成激发态物种，进一步退激产生发光。根据发光机理的不同，ECL现象被分为“湮灭型”和“共反应剂型”两种途径[2]。1.1 湮灭型ECL
如图1所示，在湮灭型 ECL 中，通过施加双向电刺激，反应体系内分别产生发光物种的氧化态和还原态中间体，两种中间体反应生成高能激发态分子，进一步退激至基态产生发光。
1.2 共反应剂型ECL
相较于湮灭型ECL，共反应剂型ECL通常具有更高的发光效率，因此电致化学发光发光成像通常基于此种模式。
共反应剂型ECL只需施加单向电位。该体系中的共反应剂提供了高能自由基，这些自由基能够与发光体反应，从而达到激发态。共反应剂ECL的机制包括“氧化还原”和“还原氧化”两种路径。以“氧化还原”ECL为例（图2A），其反应过程通常遵循三个步骤：
（1）电极表面的氧化反应；
（2）共反应剂（如三正丙胺（TPrA））生成强还原自由基；
（3）共反应剂自由基使氧化的发光中间体还原，产生激发态物种。
相应的，在“还原氧化”路径中（图2B），共反应剂（如S2O82-）产生强氧化自由基，该自由基进一步与还原态发光物种反应生成激发态。
图2. “氧化还原”（A）和“还原氧化”（B）共反应剂型ECL机制
2. 电致化学发光装置
ECLM成像装置的核心部件包括电化学反应池、电化学工作站、正置或倒置显微镜、以及CCD或EMCCD（图3）。为提高图像分辨率，通常会选用高数值孔径（N.A.）的物镜。
此外，信号发生器可作为辅助装置，对电触发与光采集进行同步。在成像操作中，关闭外部光源后，利用电位阶跃或循环伏安法触发电化学反应，同步采用CCD或EMCCD实时捕获ECL图像。
图3. ECL 显微成像系统的示意图及典型装置
3. 电致化学发光成像进展
从上世纪80年代至今，电致化学发光成像经历了蓬勃的发展。
1987年，Engstrom等报导了采用ECL成像直接观测电极的边缘效应。由于电极边缘的非线性扩散，在圆盘电极边缘处成像出非均匀的电流密度[3]。同年，该课题组报导了异质结构电极表面电化学活性的ECL直接成像[4]。这是ECL成像首次应用于电极电化学性能的表征。
1999年，Wightman课题组报导了在不同脉冲频率下，电极表面ECL成像非均匀电流密度。通过调节脉冲宽度，在高曲率的位置可获得更大的电流密度和可控的ECL光源[5]。近年来，随着成像设备的提升，ECL成像可深入单分子、单颗粒和单细胞层面，并获得微纳界面动态信息。
2008年，Bard课题组在有机相中成像出单个25nm共轭聚合物纳米粒子电子转移过程中的动态信息，开启了单体电致化学发光成像的先河[6]。法国波尔多大学Sojic课题组多年来一直致力于ECL成像与测量研究，他们报导了一种基于单个微米球的ECL反应活性成像技术。这种3D成像方法提供了一种全新的模式用于ECL反应机理研究及共反应剂效能表征，对于筛选共反应剂，提高分析灵敏度等方面都有着重要意义[7]。
2018年，徐静娟教授团队在60 nm单颗粒微纳界面上开展电子传递和物质迁移等过程的ECL成像。通过对异质金属双面神（金-铂结构）界面电化学反应的实时成像，测得异质结构纳米材料具有更高的催化转化效率及稳定性[8]。
2020年，浙江大学苏彬教授报道了基于单晶分子线的电致化学发光波导，系统地研究了在电化学激发下，单个Ir(piq)3分子线的波导行为[9]。
图4：基于单晶分子线的波导电致化学发光
2021年，浙江大学冯建东研究员课题组在Nature发表了研究论文，发展了一种单分子ECL成像技术，对ECL中单个分子发射的单个光子的位置进行成像[13]，并使用极稀释的溶液来确保这些分子在空间上分开。该技术用于空间高斯拟合后可以打破光学衍射极限，使其成像分辨率媲美超分辨率荧光显微镜。
图5：活体细胞的单分子ECL成像
上海大学赵微教授与南京大学徐静娟教授联合在JACS报道了基于发光径向涨落的超分辨成像（SRRF）的超分辨ECLM[14]。通过连续采集宽场ECL图像，并求解ECL信号涨落的径向梯度变化实现超分辨成像。这种算法通过梯度收敛性逼近发光中心的真实位置，不需要特殊样品及复杂装置，且不需要数千帧的累计，在提高空间分辨率的同时，保持较高的时间分辨率，适用于动态过程成像。
图6：单颗粒ECL-SRRF成像示意图
电致化学发光成像历经数十年发展，机遇与挑战并存。设计并合成高量子产率的发光试剂，降低成像背景提高测量灵敏度，以及进一步提升成像的空间与时间分辨率，是科研人员奋进的方向。毫无疑问，这种成像技术的进步会极大地推动其在应用领域的发展，并帮助人们更多的了解科学和自然的本质。
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从左到右：UPLXAPO40XO，数值孔径1.4
UPLAPO60XOHR，数值孔径1.5
UPLAPO100XOHR，数值孔径1.5
APON100XHOTIRF，数值孔径1.7
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参考文献
1. Guo, W.; Zhou, P.; Sun, L.; Ding, H.; Su, B. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 2089-2093.
2. Zhao, W.; Chen, H. Y.; Xu, J. J. Chem. Sci. 2021, 12, 5720-5736.
3. Engstrom, R. C.; Pharr, C. M.; Koppang, M. D. J. Electroanal. Chem., 1987, 221, 251.
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8. Zhu, M. J.; Pan, J. B.; Wu, Z. Q.; Gao, X. Y.; Zhao, W.; Xia, X. H.; Xu, J. J.; Chen, H. Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 4010 –4014.
9. Guo, W.; Ding, H.; Zhou, P.; Wang, Y.; Su, B. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 6745–6749.
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11. Ma, C.; Wu, S.; Zhou, Y.; Wei, H.-F.; Zhang, J.; Chen, Z.; Zhu, J.-J.; Lin, Y.; Zhu, W. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, 60, 4907−4914.
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13. Dong, J.; Lu, Y.; Xu, Y.; Chen, F.; Yang, J.; Chen, Y.; Feng, J. Nature 2021, 596, 244−249.
14.Chen, M. M.; Xu, C. H.; Zhao, W.; Chen, H. Y.; Xu, J. J. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 18511−18518.